铜-还原碘量法测定薏苡仁可溶性糖含量
2020-03-13王春艳袁毅白雪梅
王春艳，袁毅，白雪梅
1. 贵州省粮油产品质量监督检验站（贵阳 550003）；2. 贵州省质量发展服务中心（贵阳 550003）
薏苡仁又名薏米仁、六谷子、川谷等，为禾本科植物薏苡[Coix lacryma-Jobi L. var. mayuen（Roman.）Stapf]干燥成熟种仁[1]，是中国出口的主要农产品之一[2]，出口薏苡仁主要产于贵州、云南、广西等地，贵州黔西南州兴仁县称为中国薏米之乡。薏苡仁的营养、抗癌药效价值很高[3-7]，被誉为“世界禾本科之王”[2]。虽然薏苡仁中可溶性糖含量比较低，但可溶性糖含量对其品质鉴定、加工利用以及遗传育种、植株生长有着极其重要的影响[8]。因此，测定薏苡仁中可溶性糖含量有重要意义。
可溶性糖通常是指葡萄糖、果糖等游离单糖及蔗糖等低聚糖[9]，易溶于水及乙醇溶液，是谷物中的重要组成成分，目前尚未有相关标准方法测定薏苡仁中可溶性糖含量，常见可溶性糖测定标准有NY/T 2742—2015《水果及制品可溶性糖的测定》3, 5-二硝基水杨酸比色法[10]和NY/T 1278—2007《蔬菜及其制品中可溶性糖的测定》铜还原碘量法[11]。尤亮亮等[12]做了铜还原碘量法测定玉米、小麦、高粱中可溶性糖含量的研究，由于3, 5-二硝基水杨酸法测定DNS试剂本身500 nm下有最大吸收，对结果干扰大，谷物中可溶性糖含量一般低于3%，结合相关文献对可溶性糖研究，选择蔬菜及其制品中可溶性糖的测定铜还原碘量法来测定薏苡仁中微量可溶性糖含量，并通过单因素试验考察薏苡仁提取最佳条件。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
样品和标准品：薏苡仁采自贵州省黔西南州、安顺市、盘州市，云南、广西，共计35个样品；葡萄糖（99.9%），天津普瑞邦公司提供。
1.2 试剂
酒石酸钾钠、无水碳酸钠、氢氧化钠、硫酸铜、无水硫酸钠、碘化钾、碘酸钾、盐酸、亚铁氰化钾、硫酸锌、硫酸、草酸、硫代硫酸钠，均为分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司。
500 mg/L葡萄糖标准溶液：准确称取0.125 0 g于80℃干燥2 h的葡萄糖溶于水，定容至250 mL，现用现配。
碱性铜试剂：在1 L的烧杯中按顺序溶解30.0 g酒石酸钾钠和30.0 g无水碳酸钠于200 mL热水中，再加入40 mL 1 mol/L氢氧化钠溶液，将8.0 g硫酸铜溶于80 mL热水中，边搅拌边加入到上述溶液中，然后煮沸消除溶存的空气。将120 g污水碳酸钠溶解于500 mL热水中煮沸，冷却后加入到上述铜溶液中。将8.0 g碘化钾用少量煮沸的水溶解，加入到上述铜溶液中。然后煮沸过的水将烧杯中的溶液全部转入1 L容量瓶中。准确称取0.891 7 g于105 ℃烘2 h的碘酸钾，用煮沸过的水溶解，并转入上述容量瓶中。最后用煮沸并冷却的水定容，过滤后备用[11]。
1.3 仪器与设备
CUTEL超声波清洗器（上海冠特超声仪器有限公司）；LW 20数显恒温水浴锅（北京莱伯泰科技股份有限公司）；TDZS-WS台式离心机（长沙湘智离心机仪器有限公司）；3100波通旋风磨（瑞典Perten公司）；TW 423电子天平（岛津公司）；DK-98-Ⅰ恒温水浴锅（天津泰斯特仪器公司）；移液器（德国Eppendorf公司）。
1.4 试验方法
薏苡仁可溶性糖定量方法参照NY/T 1278—2007[5]《蔬菜及其制品中可溶性糖的测定铜》还原碘量法进行。
1.4.1 薏苡仁的预处理
取500 g有代表性薏苡仁，清除杂质，用四分法取样，混匀，经波通实验磨粉碎（40目），备用。
1.4.2 可溶性糖提取的单因素试验方法
1.4.2.1 提取溶剂的选择方法
可溶性糖易溶解于水及乙醇，NY/T 2742—2015[10]、NY/T 1278—2007[11]以及相关测定可溶性糖的方法[13-19]中常用的提取溶剂为水和80%乙醇，故提取溶剂的考察选择水和80%乙醇溶液。
取5 g（精确至0.001 g）薏苡仁细粉，置250 mL锥形瓶中，加100 mL提取溶剂，置于45 ℃水浴中振荡提取60 min，冷却后静置。移液器吸取50 mL上清液于100 mL蒸发皿中，置于70 ℃水浴上蒸发除去乙醇，至3 mL左右，加入蛋白沉淀剂15%亚铁氰化钾溶液和30%硫酸锌溶液各1 mL，摇匀。用蒸馏水洗入100 mL容量瓶中，定容过滤，取40 mL滤液于50 mL容量瓶中，加入1 mL 1 moL/L盐酸溶液，沸水浴水解10 min，冷却，加入2滴酚酞指示剂，用约0.5 mol/L氢氧化钠中和至红色，再用1 moL/L稀盐酸调至红色刚刚消失，定容，过滤备用；提取溶剂为水时，无需挥发，直接吸取50 mL上清液于100 mL容量瓶中，后续操作同加入蛋白沉淀剂一致。
1.4.2.2 提取方式的考察方法
可溶性糖的提取结合标准方法[20-23]及文献[8]，采用水浴振荡提取和超声提取。分别取两组5 g薏苡仁细粉，置于250 mL锥形瓶，加入80 mL水，分别于45 ℃恒温水浴振荡和45 ℃超声提取60 min，放冷，定容，混匀，静置。取50 mL上清液于100 mL容量瓶中，加水至刻度，过滤，取40 mL滤液于50 mL容量瓶中，加入1 mL 1 moL/L盐酸溶液，沸水浴水解10 min，冷却，加入2滴酚酞指示剂，用约0.5 mol/L氢氧化钠中和至红色，再用1 mol/L稀盐酸调至红色刚刚消失，定容，即得供试品溶液，每组样品取3份平行试样。
1.4.2.3 不同提取时间的考察方法
分别取6份5 g薏苡仁细粉，置250 mL锥形瓶中，加100 mL提取溶剂，分别于45 ℃水浴中振荡提取15，30，40，60，75，90，105和120 min，静置冷却。量取50 mL上清液置100 mL容量瓶中，照“1.4.2.2”项下自“加水至刻度”起处理样品。
1.4.3 铜还原碘量法的方法学考察方法
1.4.3.1 葡萄糖标准溶液的配制
精确称取0.102 5 g干燥恒质量（100 ℃）的葡萄糖，加适量去离子水的溶解，转移至250 mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀，配成质量浓度为0.5 mg/mL的标准葡萄糖溶液，备用。
1.4.3.2 葡萄糖标准溶液的滴定
用移液管吸取0，1.0，2.0，3.0，4.0和5.0 mL葡萄糖标准溶液于100 mL锥形瓶里，各加水至总体积5.0 mL，加入5.00 mL铜试剂，锥形瓶或试管口上加盖小漏斗，用相应的架子固定，置沸水浴中加热15 min。取出后立即置于冷水中，冷却至常温，沿壁加入2 mL硫酸+草酸混合液，立即摇动，使氧化亚铜沉淀完全溶解。当用0.005 mol/L的硫代硫酸钠工作溶液滴定至浅黄绿色时，加入约0.5 mL淀粉指示剂，滴定至蓝色消失为终点。以空白试验与标准葡萄糖液滴定值差为纵坐标，绘制标准曲线。
1.4.3.3 薏苡仁可溶性糖的测定方法
用移液管吸取1～5 mL滤液于锥形瓶中，加水至5.00 mL，加入5.00 mL铜试剂，以下按上述“1.4.3.2”标准曲线的制作起操作，记录滴定值V，同时以水代替试样做空白，将空白试验与试样滴定差值代入回归方程即可求得试样中可溶性糖质量浓度（mg/mL），薏苡仁可溶性糖含量按式（1）计算。
式中：X表示样品中可溶性糖的含量，%；A表示将空白与样品滴定值差代入标准曲线求得样液中葡萄糖的质量，mg；m表示样品质量，g；V表示测定时吸取的样液体积，mL；H表示样品水分含量，%。
取两次测定结果的平均值，计算结果保留到小数点后两位。如试样与铜试剂加热反应后，砖红色氧化亚铜沉淀较多看不到蓝色，则样品含糖量偏高，可酌情吸取1～4 mL样液，加水至5.00 mL测定，滴定值应不高于标准曲线的最高点。
1.4.3.4 精密度考察方法
选取黔西南州Q2018001、Q2018002样品，按“1.4.2.1”项下方法制成样品溶液，分别取2 mL滤液于150 mL锥形瓶里，照“1.4.3.2”项下“加水至5 mL”起依法测定硫代硫酸钠消耗体积，同法平行操作6份，得出平均消耗体积，计算样品含量及变异系数（%）。
1.4.3.5 样品处理液稳定性考察方法
取样品水解液，过滤，在室温下放置0，10，20，30和60 min，分别取2 mL滤液于150 mL锥形瓶里，照“1.4.3.2”项下“加水至5 mL”起依法测定硫代硫酸钠消耗体积，同法平行操作3份，得出平均消耗体积。
1.4.3.6 加样回收率考察方法
准确称取12份同一份薏苡仁样品，分4组，其中3组分别加入25，50和100 mg三个不同梯度的葡萄糖，按“1.4.2.1”项下方法制成样品溶液，分别取2 mL滤液于150 mL锥形瓶里，照“1.4.3.2”项下“加水至5 mL”起依法测定硫代硫酸钠消耗体积，同法平行操作3份，得出平均消耗体积，计算可溶性糖含量。
1.4.3.7 标准曲线稳定性考察方法
在间隔3个月后，重新配置葡萄糖标准溶液，按“1.4.3.2”项下制作标准曲线。
2 结果与分析
2.1 提取溶剂及温度的选择结果
在45 ℃条件下，两种提取溶剂测定薏苡仁可溶性糖含量结果见表1。两种提取液对薏苡仁可溶性糖的测定结果相差不大，平行测定3次的结果差值为0.20%，绝对差值不超过算术平均值的5%。因此，水和80%的乙醇均可用于薏苡仁可溶性糖的提取。但提取溶剂为80%乙醇时，处理过程需要将80%乙醇水浴挥干，耗时长约3 h；然而，当提取溶剂为水时，不需要挥发，为节约处理样品时间，提取溶剂选择水。
由于薏苡仁中淀粉含量较高，平均约50%，淀粉不溶于冷水，在高温高压下易溶于热水，参考GB 5009.7—2016[24]及GB/T 5513—2008[25]，含淀粉的食品测定还原糖时，提取温度为45 ℃，因此薏苡仁提取温度选择为45 ℃。
表1 两种提取液测定薏苡仁可溶性糖含量结果
2.2 提取方式的考察结果
超声提取和水浴振荡提取，薏苡仁可溶性糖含量平均值分别为：2.38%，RSD=4.20%（n=3）；2.48%，RSD=4.03%（n=3）。这两种提取方式RSD值均小于5%，结果并无显著性差异，由于超声提取噪音较大，运行时间超过1 h后，超声波机体温度升高，不利于提取温度的控制，故提取方式选择水浴振荡。
2.3 不同提取时间的考察结果
由图1可以看出，不同提取时间对薏苡仁可溶性糖提取有一定影响。提取时间在15～60 min范围内，可溶性糖含量随着时间的延长而大幅度提高，60 min后趋于平稳。这说明随着时间的延长，提取溶剂较好地渗入薏苡仁颗粒的组织和细胞中，使其充分溶胀，骨架结构伸展，可溶性糖充分溶出，提取时间的延长，其提取效率接近极限，不再增加。因此，水浴振荡时间选择60 min。
图1 不同提取时间对薏苡仁可溶性糖含量的影响
2.4 方法学考察结果
2.4.1 标准曲线的绘制与薏苡仁可溶性糖的测定结果
如图2所示，经Excel表格数据处理，葡萄糖标准曲线回归方程y=4.902 9x+0.238 1，R2=0.998 8。结果表明葡萄糖含量在0～2.5 mg范围内线性关系良好。
图2 葡萄糖标准曲线
2.4.2 薏苡仁可溶性糖的测定结果
根据以上单因素试验考察结果，薏苡仁中可溶性糖提取条件为：取5 g（精确至0.001 g）薏苡仁细粉，置250 mL锥形瓶中，加100 mL提取溶剂，置于45 ℃水浴中振荡提取60 min，冷却后静置。移液器吸取50 mL上清液于100 mL容量瓶中，加入蛋白沉淀剂15%亚铁氰化钾溶液和30%硫酸锌溶液各1 mL，摇匀，定容过滤，取40 mL滤液于50 mL容量瓶中，加入1 mL 1 moL/L盐酸溶液，沸水浴水解10 min，冷却，加入2滴酚酞指示剂，用约0.5 mol/L氢氧化钠中和至红色，再用1 mol/L稀盐酸调至红色刚刚消失，定容，过滤备用。按1.4.3.3测定计算结果，最终35批次薏苡仁可溶性糖含量见表2。
2.4.3 精密度试验结果
选取黔西南州Q2018001、Q2018002样品，按照上述方法进行检测，测定结果见表3。结果表明，使用铜还原碘量法测定的结果具有良好的重复性，变异系数小于5%。
表2 薏仁米中可溶性糖质量分数 %
表3 精密度试验结果
2.4.4 样品处理液稳定性考察结果
精密吸取2 mL滤液在室温下放置0，10，20，30和60 min，按照“1.4.3.2”项下“加水至5 mL”起依法测定硫代硫酸钠消耗体积，结果显示RSD为1.6%，表明样品处理液在室温下放置1 h内稳定性良好。
2.4.5 加标回收率考察结果
准确称取12份同一薏苡仁样品，分成4组，其中1组为本底，2，3和4组各添加一定量的葡萄糖，每个水平重复3次，结果如表4所示。回收率在89.5%～95.4%之间，平均回收率为91.6%。
表4 加标回收率结果
2.4.6 标准曲线稳定性考察结果
在间隔3个月后，重新配置葡萄糖标准溶液，硫代硫酸钠所耗体积与3个月前一致，表明铜试剂在3个月内稳定，重复测样时，标准曲线可不用重新制作。
3 讨论
含淀粉类样品测定可溶性糖时，提取溶剂多为80%的乙醇，但后续处理过程需要挥干乙醇，耗时较长，试验选择水为提取溶剂，无需挥发，减少试验操作时间。在间隔3个月后重新取铜试剂制作葡萄糖标准曲线，硫代硫酸钠所耗体积与3个月前一致，表明铜试剂在3个月内稳定，重复测样时，标准曲线可不用重新制作。
对于检出限的确证，根据文献[26]，检出限大多是空白溶液的测试上线，即能与空白溶液有明显差别。此次试验中空白溶液消耗硫代硫酸钠的体积为22.0 mL，检出限确证试验为：在100 mL水溶液中加入1 mg葡萄糖，按“1.4.2.1”项下方法制成样品溶液，分别取5 mL滤液于150 mL锥形瓶里，按照“1.4.3.2”项下“加水至5 mL”起依法测定硫代硫酸钠消耗体积，平行操作3份，消耗的硫代硫酸钠体积分别为21.7，21.6和21.6 mL，与空白值22.0 mL有差异，因此，此方法对可溶性糖含量的检出限为0.2 mg/g。
4 结论
通过单因素试验，优化确定薏苡仁可溶性糖的最佳提取条件：取5 g薏苡仁细粉，置250 mL锥形瓶中，加100 mL水（提取溶剂），置于45 ℃水浴中振荡提取60 min。并依据标准NY/T 1278—2007，探索铜还原碘量法测定薏苡仁可溶性糖含量的适用性，做方法学考察试验。结果表明，此方法灵敏度高，稳定性强，重复性好，铜还原碘量法适用于薏苡仁可溶性糖含量测定。在此基础上测定35批次薏苡仁可溶性糖含量，结果均在3%以下，且各地区薏苡仁可溶性糖含量不同，黔西南州薏苡仁可溶性糖含量最高值达到2.99%，安顺和盘州两地薏苡可溶性糖含量均在1%以下，省外云南、广西两地，由于样品数量有限，代表性不强，需做进一步样品收集。研究为后续薏苡仁品质资源开发，标准制定奠定了基础。
