透明质酸胶原蛋白冰糖燕窝研制及其改善皮肤水分功效

查圣华，王俊亮，廉翠翠，杨玉冰，秦迪，张宏

北京同仁堂健康药业股份有限公司研发中心（北京 100085）

水是人体之本，人体中水的含量依其不同发展阶段而有所不同。胎儿体内水分约占90%，婴儿为80%，青壮年为70%，中老年为60%甚至50%，所以人的老年化过程也是一种水分丢失的过程[1]。皮肤是人体最大的器官之一，约占体质量的16%。水是保护皮肤清洁、滋润、细嫩的特效而廉价的美容剂。人体皮肤表层水分在12%～15%时，皮肤光滑而有弹性，一旦缺少水分引起的干燥则严重影响肌肤健康。就改善皮肤水分而言，以往主要关注于化妆品，现在对美丽的追求趋向于“由外而内”，开始注重内部调节，“食疗”被越来越多人所追求。美容养颜类保健食品成为保健品产业内最大的细分市场之一。传统的改善皮肤水分并且已被熟知的健康食品有牛奶、蜂蜜、苹果、猕猴桃、胡萝卜、玉米、黄瓜、芦荟、海藻等。而新型的改善皮肤水分功能因子有透明质酸、多肽、神经酰胺、葡聚糖胺、硫酸软骨素、大豆异黄酮等[2-7]。

透明质酸又名玻璃酸，是一种高分子量的直链多糖，广泛存在于生物体结缔组织中，它是人皮肤表皮及真皮的主要基质成分之一，具有明显的亲水特性，可促进水合作用和提高皮肤塑性。存在于表皮中的透明质酸，在表皮屏障功能和角质层水合作用中起一定作用[8]。透明质酸分子链之间相互缠绕成连续的网状结构，水分子通过极性键和氢键与透明质酸直接作用，使得透明质酸像分子海绵一样，可吸收和保持其自身重量上千倍的水分，是国际公认最好的保湿剂，有“天然保湿因子”之称[9]。胶原蛋白是以鱼皮为原料，经酶解后制成的分子量小、消化吸收率高的胶原低聚肽，胶原低聚肽中含有大量的亲水基，使之具有良好的保湿功效，能够达到保持肌肤润泽度的目的。胶原低聚肽分子外侧亲水基团羧基与羟基等的大量存在，使胶原肽分子极易与水形成氢键，因此胶原低聚肽具有良好的保水保湿性能[10]。燕窝是目前广受消费者欢迎的美容养颜滋补品，研究表明，糖蛋白是燕窝的主要组成成分，也是重要的活性成分之一，使燕窝兼具蛋白质与糖类2种特性[11]。糖蛋白中最具价值的是唾液酸，即N-乙酰基神经氨酸，又名燕窝酸，由一系列9-碳单糖衍生而来，是燕窝中最关键的生物活性成分。燕窝中含有一种非常重要的多肽类激素-表皮生长因子（EGF）。Kong等[12]、江润祥等[13]使用各种生化方法，如测定分子量、竞争结合化验、凝胶电泳等，最早发现燕窝中含有类似表皮生长因子（EGF）活性物质，这种物质与小鼠体内分离出的EGF具有许多相似的物理性质。作为蛋白质家族中一个重要生长因子，EGF对于在靶细胞中的增殖、分化与存活起着关键作用[14]。它能刺激多种细胞的分裂增殖，促进细胞分化，对受损皮肤进行快速修复，促进手术创口和创面愈合；它能影响人体皮肤的细腻和老化，能启动衰老皮肤细胞，使皮肤变得光滑而有弹性，因此被誉为“美容基因”。虽然这些功能因子具有较好的改善皮肤水分及美容养颜功效，但市场上未见以透明质酸、胶原蛋白及燕窝为主要原料配合使用的美容养颜产品。因此，以透明质酸、胶原蛋白及燕窝为主要原料，研制一种美容养颜的燕窝保健食品，并对研制样品改善皮肤水分功效及安全性进行研究，从而为燕窝美容养颜产品开发提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

燕窝（马来西亚PT Swift Marketing Sdn Bhd公司）；透明质酸钠（华熙福瑞达生物医药有限公司）；海洋鱼胶原蛋白肽（北京盛美诺生物技术有限公司，以罗非鱼鱼皮为原料，经过清洗、老化、酶解、灭酶、脱色、过滤、精制、除菌过滤、浓缩、保安过滤、喷雾干燥等工艺制备而成，平均分子量≤1 000 μ）；冰糖（河间市太极宫糖业有限公司）；琼脂（石狮市环球琼胶工业有限公司）；安慰剂（在包装、外观、色泽及口感与研制的透明质酸胶原蛋白冰糖燕窝基本保持一致）；试验用生化试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 仪器与设备

离心脱水机（东莞市鑫洪佳通用机械设备有限公司）；安瓿水浴灭菌器（ASMDE-2.5型，山东新华医疗器械股份有限公司）；皮肤分析仪（SHP88，德国Courage+Khazaka公司）；全自动血液细胞分析仪（BC-5300，迈瑞医疗国际有限公司）；尿液分析仪（Mission U500，艾康生物技术有限公司）；全自动生化分析仪（Liasys，意大利AMS公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 透明质酸胶原蛋白冰糖燕窝生产工艺流程

1.3.2 生产工艺步骤及要点

1) 原料验收：主要原料透明质酸钠、胶原蛋白、燕窝等按照企业标准进行验收；冰糖、琼脂辅料按照国家标准进行验收。检验合格后，进入10万级生产洁净区。

2) 燕窝泡发、挑选、清洗：将配方量的燕窝，以10倍量水泡发，挑选杂质，清洗，离心脱水，备用。

3) 透明质酸钠、胶原蛋白溶解：将配方量透明质酸钠加到约25倍量纯化水中，搅拌至溶解，经300目滤网过滤，备用；将配方量胶原蛋白加到约5倍量纯化水中，搅拌至溶解，经300目滤网过滤，备用；将配方量冰糖、琼脂加入到约5倍量纯化水中，加热至溶解，经300目滤网过滤，备用。

4) 混合、定量：将透明质酸钠溶液、胶原蛋白溶液与冰糖琼脂溶液混合均匀，冷却降温至30 ℃以下。将净燕窝与上述混合液加纯化水定量，混合20 min。

5) 灌装：灌装至清洗过的70 mL玻璃瓶中，控制每瓶净含量70 g。

6) 灭菌、挑选：将瓶装产品置水浴灭菌柜中灭菌，121 ℃，20 min。灭菌后挑选剔除鼓盖品、裂纹品，炸裂品。

7) 外包装、成品入库：外包装后，按规定随机抽取每批产品，按照标准所述方法及要求进行检验，检验合格后成品入库。

1.3.3 感官评价方法

感官评定由10人（5男5女）经过专业感官评价培训的评价员组成评价小组，分别对研制样品进行色泽、气味、滋味、稳定性4个指标进行感官评价。各原料添加量试验及正交试验感官评价标准如表1。

表1 感官评定标准

1.4 配方设计研究

以燕窝、透明质酸钠、胶原蛋白为主要原料，冰糖、琼脂、水为辅料研制一种燕窝保健食品。根据预试验及现有工艺设备条件，确定透明质酸胶原蛋白冰糖燕窝规格为每瓶70 g。通过预试验及各原料添加量单因素试验确定各原料最佳添加量，并通过对燕窝、胶原蛋白、冰糖粉、琼脂添加量设计正交试验，优化产品最终配方。

1.4.1 透明质酸钠添加量确定

根据透明质酸钠在保健食品中的限量要求及参考食品药品监督管理总局相关改善皮肤水分功效保健食品中透明质酸钠起效量，确定每日食用透明质酸含量90 mg；因此配方中透明质酸钠含量90 mg/70 g。

1.4.2 胶原蛋白添加量确定

根据预试验结果，确定胶原蛋白添加量为0.5，1.0，1.5，2.0和2.5 g进行胶原蛋白添加量试验，分别添加透明质酸钠90 mg，燕窝1.5 g，冰糖粉6 g，琼脂100 mg，按照1.3.2步骤配置10罐样品，并按照表1进行感官评定。

1.4.3 燕窝添加量确定

根据预试验结果，确定燕窝添加量为0.5，1.0，1.5，2.0和2.5 g进行燕窝添加量试验，添加透明质酸钠90 mg，冰糖粉6 g，以1.4.2确定胶原蛋白最佳添加量，琼脂100 mg，按照1.3.2的步骤配置10罐样品，并按照表1进行感官评定。

1.4.4 琼脂添加量确定

根据预试验结果，确定琼脂添加量为50，75，100，125和150 mg进行琼脂添加量试验，添加透明质酸钠90 mg，冰糖粉6 g，胶原蛋白、燕窝添加量以1.4.2、1.4.3确定添加量。按照1.3.2的步骤配置10罐样品，并按照表1进行感官评定。

1.4.5 冰糖添加量确定

根据预试验结果，确定冰糖粉添加量为5，6，7，8和9 g进行冰糖粉添加量试验，透明质酸钠、胶原蛋白、燕窝添加量以1.4.1、1.4.2、1.4.3、1.4.4确定添加量，按照1.3.2的步骤配置10罐样品，并按照表1进行感官评定。

1.4.6 正交试验配方优化

根据单因素试验结果确定以燕窝、胶原蛋白、冰糖粉、琼脂为主要原料，通过四因素三水平试验模型L9(34)进行配方优化，根据单因素试验结果及考虑到产品成本，配方优化各原料水平选择如表2。按照各组试验配方按照1.3.2步骤各配置10罐样品，按照表1进行感官评定。

表2 原辅料用量因素水平表

1.5 人体试食方法

1.5.1 受试对象

1.5.1.1 纳入标准

经体验合格的自愿受试者。年龄在30～50岁，皮肤水分≤12%。

1.5.1.2 排除标准

年龄有30岁以下或者50岁以上者，妊娠或哺乳期妇女，过敏体质及对本品过敏者；合并有心、肝、肾和造血系统等严重疾病及内分泌疾病，精神病患者；短期内服用与受试功能有关的药品或保健品，影响到对结果的判断者；未按规定服用受试样品，无法判断疗效或安全性者。

1.5.2 试验方法

采用组间对照和自身对照设计。将符合纳入标准并保证配合试验的自愿受试者，按受试者的皮肤水分情况随机分为受试组与对照组。并尽可能考虑影响结果的主要因素如年龄等，进行均衡性检验。试验采用双盲法，受试组与对照组均按1 d 1瓶服用透明质酸胶原蛋白冰糖燕窝或者安慰剂，连续30 d。2组受试者在试验期间停止使用其他口服及外用有关保持皮肤水分的用品。试验期间不改变原来的饮食习惯，正常饮食。

1.5.3 观察指标

各项观察指标于试食试验开始及结束时各测定1次。

试验前详细询问受试者健康状况，了解受试者的精神、睡眠、饮食、大小便等情况，并测量体质量、血压、心率等，对所有受试者进行常规体格检查及必要的实验室检查。

血常规：红细胞计数、白细胞计数、血红蛋白含量测定等。

尿常规：pH、白细胞、尿糖等。

粪便常规：虫卵检查等。

生化指标检测：血清总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、胆固醇（CHOL）、甘油三酯（TG）、尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）、尿酸（UA）、血糖（GLU）等。

心电图、腹部B超、胸透等检查。

皮肤水分测试：有宽敞、通风良好、温度、湿度等空间环境稳定的检查室进行，在安静状态下，用洁净的棉球蘸蒸馏水清洁被测部位，擦干后15 min进行水分的测定，试食前测定工作由同1台仪器、同1人操作。

1.5.4 结果判定

1.5.4.1 有效

经仪器测定水分得到改善。

1.5.4.2 无效

水分没有得到显著改善。

1.6 统计学处理

数据以均数±标准差表示，自身配对资料采用配对t检验，试验组和对照组之间在方差齐同的前提下，采用成组t检验方差不齐采用秩和检验。所有数据均采用SPSS 22.0软件进行处理。

2 结果与分析

2.1 配方研究试验结果

2.1.1 原料添加量及单因素试验结果

各原料添加量及单因素试验按照1.4.1～1.4.5试验方法进行试验，并按照表1感官评价标准对各个试验样品进行感官评定，其试验结果如图1～图4。

由图1～图4可知，胶原蛋白、燕窝、琼脂、冰糖添加量对产品感官影响较大。随着胶原蛋白粉、燕窝、琼脂及冰糖粉添加，各试验样品产品感官均先增加后下降，且在试验添加量范围内，胶原蛋白添加量1.5 g，燕窝添加量2 g，冰糖粉添加量7 g，琼脂添加量125 mg时，各试验样品感官评分最高。因此通过图1～图4试验结果，确定以胶原蛋白、燕窝、冰糖粉、琼脂为原料，设计四因素三水平正交试验，优化产品配方。因为可以通过调整琼脂及胶原蛋白添加量增加产品黏稠度，考虑到产品成本，燕窝添加量选用1～2 g进行配方优化。

图1 胶原蛋白添加量对感官影响

图2 燕窝添加量对感官影响

图3 琼脂添加量对感官影响

图4 冰糖添加量对感官影响

2.1.2 正交试验结果

按照表1感官评价标准评价L9(34)的正交试验中各试验号样品感官，其最后得分如表3所示。由表3中的极差分析结果可知，各因素对试验样品的综合得分影响因素为A＞C＞B＞D；因此燕窝添加量对产品感官影响最大。从感官结果可知，7号试验样品（A3B1C3D2）得分数最高。极差分析的最佳组合为A3B2C3D2，将这2个组合物做验证对比试验，A3B2C3D2组合综合评分为91.6分，验证正交试验理论组合的可靠性，即最佳配方为：燕窝添加量2 g、胶原蛋白添加量1.5 g、琼脂添加量150 mg，冰糖粉添加量7 g。

2.2 改善皮肤水分功效试验结果

2.2.1 试食前后一般情况

初始试验人群对照组组51例，男/女为32/19，试验组51例，对照组51例，男/女为32/19。对照组年龄33.98±2.72岁；试验组年龄34.10±2.90岁。30 d试验后，试验组与对照组均无受试者因间断服用受试品或无法判断效果被筛除。

2.2.2 安全性指标

2.2.2.1 一般情况

试食期间，受试组未观察到明显过敏及其他不良反应，精神、睡眠、饮食、大小便情况良好。

2.2.2.2 体质量、血压、心率、尿常规、大便常规、血常规及生化指标

由表4和表5可知，食用受试物30 d后，试食组和对照组体质量、血压、心率未见明显异常改变，尿常规、大便常规、血常规及生化指标均在正常范围内，提示透明质酸胶原蛋白冰糖燕窝对人体健康无明显损害。

表3 正交试验结果与分析

表4 体质量、血压、心率、尿、大便、血常规检测结果（）

表4 体质量、血压、心率、尿、大便、血常规检测结果（）

试食组试食前 试食后 试食前 试食后体质量/kg 61.75±11.89 61.85±11.95 60.04±11.97 59.99±11.71收缩压/mmHg 111.41±9.05 110.35±8.88 111.39±10.66 109.82±9.18舒张压/mmHg 68.59±5.42 69.51±6.35 69.65±6.85 69.04±5.81心率/(次·分-1) 77.80±8.81 75.94±9.14 77.84±6.37 77.73±7.66白细胞/(109·L-1) 6.65±1.35 6.65±1.22 6.59±1.42 6.42±1.31红细胞/(1012·L-1) 4.87±0.46 4.77±0.44 4.83±0.48 4.81±0.44血红细胞/(g·L-1) 146.33±14.08 140.49±13.66 145.84±26.79 139.71±11.95尿常规 正常 正常 正常 正常大便常规 正常 正常 正常 正常指标 对照组

表5 生化指标检测结果（）

表5 生化指标检测结果（）

指标 对照组试食组试食前 试食后 试食前 试食后血糖/(mmol·L-1) 4.62±0.55 4.59±0.49 4.45±0.39 4.58±0.45甘油三酯/(mmol·L-1) 1.08±0.57 1.38±0.82 1.25±1.08 1.22±0.57胆固醇/(mmol·L-1) 4.00±0.72 4.52±0.87 4.02±0.69 4.23±0.76尿素氮/(mmol·L-1) 5.00±1.14 4.54±1.23 4.68±1.09 4.42±1.15肌酐/(μmol·L-1) 71.75±14.77 68.30±13.71 67.13±13.47 69.64±14.97尿酸/(μ mol·L-1) 316.51±62.09 313.24±67.12 318.25±50.17 316.07±66.59谷丙转氨酶/(U·L-1) 22.99±13.54 20.46±10.57 23.19±15.75 19.23±12.75谷草转氨酶/(U·L-1) 23.57±7.70 21.33±7.79 23.90±9.28 19.77±7.00总蛋白/(g·L-1) 70.31±3.02 70.46±3.95 69.33±2.62 69.81±3.01白蛋白/(g·L-1) 44.87±2.25 44.96±2.60 44.76±2.05 44.31±2.58

2.2.2.3 心电图、腹部B超、胸透检查结果

均在正常范围内。

2.2.3 功效观察皮肤检测结果

由表6所示，试食组的皮肤水分在试食后明显提高，与试食前比较差异有显著性差异（p＜0.05），与对照组相比也有显著性差异（p＜0.05）。最佳配方研制透明质酸胶原蛋白冰糖燕窝产品对改善人体皮肤水分有显著作用，且对身体健康没有影响。试验组皮肤含水量平均值由试验前的8.73±1.10提高到9.65±1.11。

表6 皮肤检测结果（）

表6 皮肤检测结果（）

组别 皮肤水分试食前 试食后对照组 8.72±1.00 8.76±1.00试食组 8.73±1.10 9.65±1.11*#注: 自身对照*, p＜0.05; 组间对照#, p＜0.05

冯宁等[15]研究口服透明质酸对皮肤水分的改善作用及体内抗氧化作用，结果表明，试食组的肤水分明显提高，与试食前和对照组比较，差异均有统计学意义（p＜0.05）；试食组血清SOD活性与对照组试食后及自身试验前比较，差异均有统计学意义（p＜0.05）；受试者安全性指标均在正常范围内，口服HA可改善人体皮肤水分，具有体内抗氧化作用，且口服安全性高。左红梅等[16]研究胶原蛋白维E颗粒对皮肤水分改善作用，结果表明，胶原蛋白维E颗粒能明显提高皮肤水分，且无任何不良反应。王宁等[17]研究海洋鱼胶原低聚肽和透明质酸复配对改善女性皮肤水分作用，结果表明，胶原低聚肽和透明质酸复配对改善女性皮肤水分有显著作用，且对健康没有影响。Abidin等[18]

将燕窝提取物加到培养兔角膜细胞的血清培养基中，观察其形态学变化，RT-PCR方法测定基因表达，试验证明，燕窝有助于兔角膜的细胞分裂、促进再生，这将有利于角膜损伤治愈过程。研究表明，透明质酸、胶原蛋白及燕窝具有改善皮肤水分及美容养颜的功效。试验结果表明，以透明质酸、胶原蛋白及燕窝为主要原料，研制的燕窝保健食品具有显著改善皮肤水分功效。因此将透明质酸、胶原蛋白与燕窝复配开发燕窝保健食品丰富美容养颜产品市场，将具有广阔的市场前景。

3 结论

以燕窝、透明质酸钠、海洋鱼胶原蛋白为主要原料，冰糖、琼脂、纯化水为辅料，研制一种燕窝罐头食品，其主要工艺包括原料验收、燕窝泡发、清洗、混合定量、灌装、灭菌、包装检验等。通过正交试验及感官评定，确定产品最佳配方为：每70 g产品含有透明质酸钠90 mg、胶原蛋白1.5 g、燕窝2 g、琼脂150 mg、冰糖粉7 g，其余为水。此配方研制的透明质酸胶原蛋白冰糖燕窝黏稠度合适，产品分散性良好，口感丝滑，甜度合适，具有燕窝特有口感。对最佳配方试验样品进行改善皮肤水分功效及安全性研究，将自愿受试者按皮肤水分情况随机分为试食组和对照组，分别使用透明质酸胶原蛋白冰糖燕窝和安慰剂，试验后结果表明，试食组皮肤水分在试食后明显提高，与试食前比较差异有显著性（p＜0.05）与对照组比较差异也有显著性（p＜0.05），试验组皮肤含水量平均值由试验前的8.73±1.10提高到9.65±1.11。说明该最佳配方透明质酸胶原蛋白冰糖燕窝具有改善皮肤水分的功能作用。试食透明质酸胶原蛋白冰糖燕窝前后，血常规、血生化等各项指标均在正常范围内，也未观察到过敏及其他不良反应。开发一种风味及功效俱佳的燕窝保健食品，对美容养颜产品开发提供参考依据。