芦笋下脚料可溶性纤维的提取及其抗氧化性

2020-03-13王瑶吴茂玉王兆升张明杨立风马超

食品工业 2020年2期

王瑶，吴茂玉，王兆升，张明，杨立风，马超*

1. 中华全国供销合作总社济南果品研究院（济南 250014）；2. 山东农业大学食品科学与工程学院（泰安 271000）

芦笋（Asparagus officinalis Linn.）又名石刁柏，为百合科天门冬属植物。芦笋含有多种游离氨基酸、维生素、微量元素等营养成分，以及皂苷、黄酮等药用成分，具有较高的食用和药用价值[1]。芦笋下脚料为芦笋速冻产品或罐头产品加工后所剩下的老茎等部分，约占鲜样的40%[2]。废弃物中含有丰富的活性物质膳食纤维，并具有降低过氧化脂质、胆固醇，提高超氧化物歧化酶活性和免疫器官质量的作用，能明显地延缓衰老和提高免疫，是值得研究和开发利用的可贵资源。

关于芦笋可溶性膳食纤维（SDF）的研究主要集中在鲜食部分的抗衰老、抗肿瘤、增强免疫力等方面[3]。有关芦笋下脚料可溶性膳食纤维的提取及抗氧化功能的未见系统研究。在实际生产中大部分被丢弃，不仅造成资源浪费，而且有碍环境友好型产业建设。试验以绿芦笋加工下脚料为原料，采用响应面试验来确定芦笋可溶性膳食纤维超声辅助酶法提取的最佳工艺，并对其抗氧化活性进行系统研究，以期为芦笋下脚料功能食品及药品的开发提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 试验材料与试剂

芦笋下脚料；淀粉酶（800 U/mL）、蛋白酶（2 500 U/mL）（均为Solarbio公司）；乙醇；水杨酸；FeSO4；双氧水；DPPH标准品；铁氰化钾；三氯乙酸；FeCl3；FeCl2；磷酸氢二钠；磷酸二氢钠；菲啰嗪等。

1.2 仪器与设备

RHP-250A型高速多功能粉碎机（浙江永康市荣浩工贸有限公司）；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵（郑州长城工贸有限公司）；TDL-5-A离心机（上海安亭科学仪器厂）；KQ-250B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；PHS-3 C pH计（上海仪电科学仪器股份有限公司）；ME104电子天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；SHA-B双功能水浴恒温振荡器（江苏杰瑞尔电器有限公司）；UV 1000紫外可见分光光度计（上海天美科学仪器有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 芦笋下脚料可溶性膳食纤维提取工艺

芦笋下脚料→洗净、烘干→粉碎→酶解和超声提取→抽滤→醇沉→离心→干燥、称质量→芦笋SDF

1.3.2 单因素试验

1.3.2.1 酶添加量

称取芦笋加工下脚料3.00 g，加入60 mL蒸馏水，调pH 5.5～7.0，分别加入0.5，0.6，0.7，0.8和0.9 mL淀粉酶，混匀，90 ℃水浴振荡1 h，冷却。加入0.4 mL蛋白酶，混匀，45 ℃振荡水浴1 h，冷却。抽滤，浓缩，加入4倍体积的无水乙醇，静置过夜，离心（4 000 r/min，5 min），沉淀物烘干后即为可溶性膳食纤维，称质量，并计算得率。讨论不同淀粉酶用量对芦笋SDF得率的影响[8]。

称取芦笋加工下脚料3.00 g，加入60 mL蒸馏水，调pH 5.5～7.0，0.7 mL淀粉酶，混匀，90 ℃水浴振荡1 h，冷却。分别加入0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mL蛋白酶，混匀，45 ℃振荡水浴1 h，冷却。抽滤，浓缩，加入4倍体积的无水乙醇，静置过夜，离心（4 000 r/min，5 min），沉淀物烘干后即为可溶性膳食纤维，称质量，并计算得率。讨论不同蛋白酶用量对芦笋SDF得率的影响。

1.3.2.2 超声位置

称取芦笋加工下脚料3.00 g，加入60 mL蒸馏水，调pH 5.5～7.5，加入0.7 mL淀粉酶，混匀，90 ℃水浴振荡1 h，冷却。加入0.6 mL蛋白酶，混匀，45 ℃振荡水浴1 h，冷却。分别在加淀粉酶之前、淀粉酶酶解过程中、加蛋白酶之前、蛋白酶酶解过程中、蛋白酶酶解后五个位置进行超声处理20 min。抽滤，浓缩，加入4倍体积的无水乙醇，静置过夜，离心（4 000 r/min，5 min），沉淀物烘干后测得可溶性膳食纤维得率。研究不同超声位置对绿芦笋加工下脚料可溶性膳食纤维得率的影响。

1.3.2.3 超声时间

称取芦笋加工下脚料3.00 g，加入60 mL蒸馏水，分别进行超声处理5，10，20，30和40 min。调pH 5.5～7.5，加入0.7 mL淀粉酶，混匀，90 ℃水浴振荡1 h，冷却。加入0.6 mL蛋白酶，混匀，45 ℃振荡水浴1 h，冷却。抽滤，浓缩，加入4倍体积的无水乙醇，静置过夜，离心（4 000 r/min，5 min），沉淀物烘干后测得多糖得率。研究不同超声时间对绿芦笋加工下脚料可溶性膳食纤维得率的影响。

1.3.3 响应面设计方案

根据单因素试验结果，选择淀粉酶添加量、蛋白酶添加量、超声时间4个对芦笋SDF提取率影响显著的因素为响应变量，SDF得率为响应变量，进行响应面优化试验。采用Design-Expert 8.0统计软件，进行Box-Behnken试验方案，设计四因素三水平二次回归方程，拟合各因素和SDF得率之间的函数关系。试验因素水平见表1。

表1 Box-Behnken响应面设计试验因子与水平表

1.3.4 芦笋下脚料SDF的抗氧化性分析

将提取的SDF进行复溶，按照Sevage法（V提取液∶V氯仿∶V正丁醇=100∶20∶4）进行脱蛋白处理。

1.3.4.1 DPPH自由基清除能力测定

取0.5 mL样品溶液与2.5 mL 6×10-5mol/L的DPPH溶液充分混匀，避光静置30 min，于515 nm处测吸光度A1。同理测定2 mL样品溶液与2 mL无水乙醇充分混匀后的吸光度A2，2 mL蒸馏水与2 mL DPPH溶液充分混匀后的吸光度A0[4]。同时以相同条件下直接水提的SDF溶液作对照。

1.3.4.2 还原力的测定

分别取不同浓度的样品提取液1 mL，加入0.2 mL的0.2 mol/L的磷酸盐缓冲溶液（0.2 mol/L磷酸二氢钠溶液62.5 mL+0.2 mol/L磷酸氢二钠溶液37.5 mL）和0.5 mL 1%的K3[Fe(CN)6]溶液。混匀后50 ℃反应20 min，冷却。加入1 mL 10%三氯乙酸溶液、0.2 mL 0.1%FeCl3溶液和3 mL的蒸馏水混匀，静置5 min，用无水乙醇代替样品溶液做空白对照，700 nm处测吸光度A[5-6]。

1.3.4.3 羟自由基（·OH）清除能力测定

分别取0.2 mL不同浓度的样品溶液，依次加入1 mL 0.15 mmol/L的FeSO4溶液，0.4 mL 2 mmol/L的水杨酸-乙醇溶液，1 mL 6 mmol/L的H2O2溶液。混匀后静置1 h，于510 nm处测吸光度A1。同时用蒸馏水代替样品溶液测得吸光度A0，用蒸馏水代替水杨酸溶液测得吸光度A[5]2。

1.4 数据分析

利用SPSS 18.0和Design-Expert 8.0数据处理软件进行数据处理及统计分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 淀粉酶添加量对芦笋下脚料可溶性膳食纤维得率的影响

由图1可知，α-淀粉酶用量对可溶性膳食纤维的含量具有限制作用[8]，随着α-淀粉酶用量增加，样品中的淀粉逐渐去除，被淀粉缠绕的可溶性膳食纤维逐渐被释放出来。α-淀粉酶用量超过0.7 mL时，SDF得率不再有明显变化。α-淀粉酶用量超过0.7 mL时，可溶性膳食纤维含量不再升高，说明此时的α-淀粉添加量对于样品达到饱和。

图1 淀粉酶添加量对绿芦笋下脚料中可溶性膳食纤维得率的影响

2.1.2 蛋白酶添加量对芦笋下脚料可溶性膳食纤维得率的影响

由图2可以看出，随着蛋白酶加入量增加，芦笋可溶性膳食纤维的提取率先呈上升后下降趋势，酶加入量0.6 mL时，提取率升至最高值。可能是因为酶浓度过低时，催化能力不够，降解出的可溶性膳食纤维量较低；而酶用量过高时，可能是因为可溶性膳食纤维中的某些糖苷键会被过量的酶分解，从而导致芦笋可溶性膳食纤维的得率下降[9]。

图2 蛋白酶添加量对绿芦笋下脚料中可溶性膳食纤维得率的影响

2.1.3 不同超声位置对芦笋下脚料可溶性膳食纤维得率的影响

根据前面单因素结果，选用淀粉酶和蛋白酶继续进行不同超声位置对可溶性膳食纤维得率的研究，由图3可以看出，得率由高到低依次是淀粉酶前、蛋白酶后、淀粉酶酶解中、淀粉酶后蛋白酶前、蛋白酶酶解中，在加淀粉酶处理之前进行超声处理效果最好，可溶性膳食纤维得率为7.84%。

2.1.4 超声时间对芦笋下脚料可溶性膳食纤维得率的影响

随着时间增加，可溶性膳食纤维得率逐渐增大，20 min时，可溶性膳食纤维得率最大，随后逐渐减低。可能是因为时间延长，超声引起的热量积聚或机械剪切作用导致可溶性膳食纤维的结构变化而损失[10]；提取时间过长，会导致可溶性膳食纤维分解，杂质溶出。

图3 超声位置对可溶性膳食纤维得率的影响

图4 超声时间对可溶性膳食纤维得率的影响

2.2 响应面优化芦笋下脚料可溶性膳食纤维提取工艺

2.2.1 回归模型建立及显著性检验

通过响应面试验设计优化可溶性膳食纤维的提取工艺，试验结果见表2。对此进行响应面分析，利用设计专家（Design-Expert 8.0）软件对试验结果进行二次多项式回归拟合，得到可溶性膳食纤维得率的回归方程模型为：SDF=8.21-0.29A-0.11B+0.25C+0.072AB-0.083AC-0.16BC-0.82A2-0.36B2-0.31C2。

所得回归模拟方程的方差分析如表3。结果表明，模型的方差分析结果为p＜0.01，表明该回归方程模型极显著，且模型失拟项p=0.331 9＞0.05不显著，复相关系数R2=0.971 3，校正系数R2adj=0.934 5，说明模型拟合程度较好，试验误差较小。

根据表3的结果可知，超声时间对可溶性膳食纤维得率的影响显著，且3个因素的二次项（X12、X22、X32）均有及显著影响；各因素对响应值的排序由大到小依次为：超声时间（X1）、淀粉酶添加量（X3）、蛋白酶添加量（X2）。通常两两因素交互作用的响应曲面图可以直观的反应两因素交互作用对响应值的影响，即响应曲面越陡，各因素对响应值的影响越显著，反之，各因素对响应值的影响较小[10]。从图5（a）～（c）中可以看出两两因素交互作用与响应值的关系，交互作用对芦笋可溶性膳食纤维的影响不显著，这与表3中两两因素交互作用的p值均大于0.05相一致。但是图5中的a、b曲面相对来说比较陡一些，说明超声时间与蛋白酶添加量、超声时间与淀粉酶添加量的交互作用对芦笋下脚料可溶性膳食纤维得率有影响（可能与超声时间影响显著有关），但交互作用影响不显著（p＞0.05）；c图曲面相对较平缓，说明淀粉酶与蛋白酶添加量的交互作用对可溶性膳食纤维得率的影响很小。

表2 响应面分析试验设计与结果

表3 回归方程系数显著性检验表

图5 两因素交互作用对可溶性膳食纤维得率影响的响应面图

2.2.2 最佳条件的确定和回归模型的验证

通过前面响应面分析得到超声辅助酶法提取芦笋下脚料可溶性膳食纤维的最佳工艺条件为：超声时间17.85 min、淀粉酶添加量0.75 mL、蛋白酶添加量0.54 mL。在此条件下理论得率为8.31%。在操作中对上述条件进行调整，确定的最佳工艺为：超声时间18 min、淀粉酶添加量0.75 mL、蛋白酶添加量0.54 mL。在调整后的条件下，进行3次验证试验，得到芦笋下脚料可溶性膳食纤维实际的提取率为8.20%，结果与理论预测较为接近。故而，该法优化得到的提取条件参数可靠。

2.3 芦笋可溶性膳食纤维抗氧化性分析

2.3.1 DPPH自由基清除能力测定结果

DPPH自由基是一种稳定的，在517 nm处有强吸收力的氮中心自由基，它可与自由基清除剂电子配对而使吸光度下降，下降程度与电子数量成正比，故被广泛用于果蔬抗氧化活性的检测[11]。

由图6可知，随着绿芦笋加工下脚料可溶性膳食纤维和VC浓度增大，对DPPH·的清除率都呈逐渐上升趋势，但1 mg/mL之后VC清除率逐渐平稳。多糖对DPPH·的清除能力低于VC，质量浓度为3 mg/mL时，可溶性膳食纤维对DPPH自由基的清除率达73.37%，VC清除率达93.20%。

2.3.2 还原能力测定结果

如图7所示，绿芦笋加工下脚料SDF还原能力与浓度呈线性相关。VC是一种极高效的还原剂，可溶性膳食纤维还原能力明显弱于VC，但随着浓度增大其还原力或可继续提升。Li等[12]研究表明，还原力强弱主要受酮类存在影响，可通过释放电子防止过氧化物的生成。由于高分子量的多糖也有供电子体，如羟基，亦可还原Fe3+，但多糖的具体还原机制仍有待研究。

图6 不同方式提取的可溶性膳食纤维对DPPH自由基的清除作用

图7 不同方式提取可溶性膳食纤维的还原力测定

2.3.3 羟自由基清除能力测定结果

羟自由基具有较强的氧化活性，可造成生物体的过氧化损伤，通常被认作是有害自由基[5]。羟自由基清除能力广泛用于评价样品抗氧化能力。由图8可知，VC和绿芦笋加工下脚料可溶性膳食纤维对羟自由基具有良好的清除作用，清除能力与浓度呈正相关，质量浓度为2 mg/mL时，羟自由基清除率97.46%，清除效果较好。