大豆蛋白的酶解及在γ-聚谷氨酸发酵工艺中的应用初探

邹水洋，叶植湘，邱华贤，陈银发

东莞理工学院，食品营养健康工程与智能化加工研究中心，化学工程与能源技术学院（东莞 523808）

大豆是一种重要的蛋白质类粮食资源，其蛋白质含量约为40%，且氨基酸模式与人体所需蛋白质模式十分相近。大豆蛋白经蛋白酶水解后生成大豆多肽、大豆寡肽以及游离氨基酸。大豆肽具有多种生物学活性，如抗氧化[1]、降血脂和胆固醇等[2-3]。另外，也有研究发现大豆肽对微生物生长与代谢有促进作用[4-6]，但这方面的研究报道还较少。

γ-聚谷氨酸（γ-polyglutamic acid，γ-PGA）是一种新型生物高分子材料，在多个工业领域应用前景广阔，其中通过γ-聚谷氨酸改变食品的生理特性、物理特性以及味觉的功能已得到应用[7]。γ-聚谷氨酸一般采用微生物发酵法合成[7]，生产成本较高，价格较昂贵。发酵工艺的改进是提高其生产水平、降低生产成本的重要途径。试验前期对γ-聚谷氨酸的发酵工艺进行了较多研究[8-9]，并选育出一株有较强合成γ-聚谷氨酸潜力的菌株[9]——枯草杆菌Dg5041，但γ-聚谷氨酸的产率还有待提高。基于大豆肽在γ-聚谷氨酸发酵生产中的应用仍鲜见报道，试验将大豆蛋白水解物用作培养枯草杆菌的氮源物质来发酵生产γ-聚谷氨酸，以期为γ-聚谷氨酸的发酵工艺提供新的基质材料，同时拓展大豆肽的应用领域。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis Dg5041，东莞理工学院微生物实验室保存）；大豆、豆芽（市售）；碱性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶（酶活20～80万 U/g，江苏锐阳生物科技有限公司）；味精（谷氨酸钠≥99%，广州奥桑味精食品有限公司）；其它试剂均为国产分析纯或生化试剂。

1.2 仪器与设备

SW-CJ-1 F净化工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；LRH-150生化培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）；YM-50立式压力蒸汽灭菌锅（上海三中医疗器械有限公司）；HQL 300 B柜式恒温冷冻摇床（武汉中科科仪技术发展公司）；TDL-5-A多管离心机（上海安亭科学仪器厂）；DD-6水浴锅（广州环宇实验仪器有限公司）；DJ 12 B豆浆机（九阳股份有限公司）；YP 5002电子天平（常州衡正电子仪器有限公司）；PHS-3 C型pH计（上海仪电科学仪器有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 大豆蛋白的酶解

豆浆的制备：大豆清洗后以1∶10的比例加入蒸馏水，室温浸泡8 h，用豆浆机打浆过滤去渣得大豆浆液，固形物浓度约为6%。

大豆蛋白的酶解：将100 mL大豆浆液装入250 mL锥形瓶，调节pH至各蛋白酶最适pH和最适温度并维持稳定，加入0.8 g蛋白酶，水浴保温搅拌120 min，加热灭酶活，冷却后，离心、过滤，去除沉淀物及漂浮的脂肪，所得浅黄色清液即为大豆蛋白水解物。

1.3.2 菌种培养与发酵生产γ-聚谷氨酸

斜面培养基和种子液培养基的配制及菌种培养方法参见文献[9]。

大豆蛋白水解物培养基：50 mL 3%固形物含量的大豆蛋白水解物装入250 mL锥形瓶，加10 g/L入葡萄糖、40 g/L谷氨酸钠，pH 7.0。以上培养基在110 ℃ 20 min灭菌后冷却至室温，备用。

γ-聚谷氨酸的发酵：按4%接种量将种子液接入大豆蛋白水解物培养基，在37 ℃ 150 r/min恒温摇床培养48 h。发酵完成后将发酵液离心分离（5 000 r/min，20 min），取上清液，测定γ-聚谷氨酸含量。枯草杆菌在普通培养基中的发酵方法参见文献[9]优化的结果。以上试验平行3次，结果取平均值。

1.4 分析测试

大豆蛋白水解度（DH）参见文献[10]提供的甲醛滴定法进行测定，DH=水解物氨态氮含量/水解物总氮含量×100%。

γ-聚谷氨酸粗品产量测定采用乙醇沉淀法[8]。

2 结果与讨论

此次研究未采用大豆分离蛋白而采用大豆浆液进行酶解试验，主要是基于实际生产的考虑。一方面大豆分离蛋白价格较昂贵，另一方面大豆浆液中除蛋白质外还含有丰富的可溶性糖类、矿物质、磷脂、维生素等营养成分，可作为后续微生物生长代谢的营养基质利用。

2.1 pH对大豆蛋白酶解的影响

酶的活性受pH的影响较为显著，在一定的pH范围内，酶才表现出催化活性。将碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶控制在55 ℃，中性蛋白酶、酸性蛋白酶控制在45℃条件下进行酶解试验，结果如图1所示。

从图1可以看出，碱性蛋白酶最适pH为9.5；中性蛋白酶和木瓜蛋白酶最适pH为7.0；酸性蛋白酶最适pH为3.5，以下试验的pH均按此优化结果。当酸碱度偏离最适作用pH时，大豆蛋白DH均有明显的下降趋势。这由于pH过高或过低可使蛋白酶的空间结构改变，从而蛋白酶失活，或者改变底物的解离状态，影响底物与酶的结合。所以，在进行大豆蛋白酶解反应中，要严格控制酶解过程的pH。

2.2 温度对大豆蛋白酶解的影响

温度对酶作用的影响比较复杂，提高温度会提高反应速率，同时也可能导致酶的变性失活，因此在最适宜的酶解温度下，才能达到最高的酶解的效率。

从图2可以看出，随着反应温度的增加，大豆蛋白DH先上升后下降，存在一个峰值，不同蛋白酶的DH峰值对应的温度有所不同，该温度即为酶的最适作用温度。碱性蛋白酶的最适作用温度为60 ℃；中性蛋白酶和酸性蛋白酶的最适作用温度为45 ℃；木瓜蛋白酶最佳的反应温度为55 ℃，以下试验均按此优化温度进行。

图1 pH对大豆蛋白酶解的影响

图2 温度对蛋白酶水解效果的影响

2.3 底物浓度对大豆蛋白酶解的影响

底物浓度不仅影响酶解速度，也关乎生产成本。通过改变打浆时料水比或稀释度将豆浆固形物含量调整至2%～10%来进行酶解试验，结果见图3。大豆蛋白DH随豆浆固形物浓度的升高而升高，在豆浆固形物浓度上升至6.0%时，大豆蛋白DH达到最高值，随后下降。底物浓度很低时，酶与底物碰撞概率小，酶解效率低。底物浓度过高，蛋白质分子会通过疏水和二硫健作用，形成网状聚合体。试验中发现豆浆固形物浓度越高，体系的流动性越差，豆浆中其他非蛋白成分越多，这些均不利于底物与蛋白酶的接触，导致酶解效率降低。考虑到成本问题，豆浆固形物浓度控制在6%较合适。

2.4 酶浓度对大豆蛋白酶解的影响

当底物浓度远大于酶浓度时，酶促反应速度随着酶浓度的增加而增加。将酶质量浓度设置为2.0～10.0 g/L进行酶解试验，酶浓度对大豆蛋白酶解的影响如图4所示。随着酶浓度的增大，大豆蛋白DH均逐渐升高，当酶质量浓度达到8.0 g/L后，酸性蛋白酶和中性蛋白酶继续提高酶浓度对大豆蛋白DH增加量很小，而碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶继续增加酶浓度使大豆蛋白DH还略有下降。这可能是蛋白酶浓度过高，会发生自水解反应[11]，导致其活力下降。综合酶解效率与成本考虑，上述4种蛋白酶的酶用量选8.0 g/L较为合理。

图3 底物浓度对大豆蛋白水解的影响

图4 酶质量浓度对大豆蛋白水解的影响

2.5 酶解时间对大豆蛋白酶解的影响

在相同的条件下，酶解时间越长，蛋白质酶解越充分，但相应生产成本也会增加。试验考察了大豆蛋白水解度随酶解时间变化的关系，结果见图5。4种蛋白酶的大豆蛋白DH-时间关系曲线类似，随着酶解时间的延长，酶解速率逐渐降低，符合一般酶解规律。当酶解时间达120 min后，大豆蛋白DH增速变缓，考虑到能耗及酶解液变质等因素，酶解时间选120 min较合适。

综合前文试验结果还发现：4种蛋白酶对大豆蛋白的酶解效果有较大差异，其中碱性蛋白酶效果最好，其次为中性蛋白酶，酸性蛋白酶和木瓜蛋白酶效果较差。不同蛋白酶对蛋白质水解的位点不同会导致酶水解能力的差异，酶解温度的不同也会对水解速率产生影响。对于大豆蛋白，碱性蛋白酶是较合适的水解酶。

2.6 大豆蛋白水解物作氮源对发酵生产γ-PGA的影响

将不同蛋白酶在优化酶解条件下得到的大豆蛋白水解物经适度稀释后（固形物浓度3%）作为氮源来制备培养基，考察大豆蛋白水解物对枯草杆菌Dg5041合成γ-PGA的影响，结果如表1所示。

从表1结果显示，大豆蛋白水解物能显著促进枯草杆菌合成γ-聚谷氨酸，其水解度越高，枯草杆菌生产的γ-聚谷氨酸越多。其中碱性蛋白酶酶解的大豆蛋白水解物DH（16.44%）最高，以此作为氮源发酵生产的γ-聚谷氨酸产量也最高，达到37.58 g/L。而使用其他蛋白酶酶解的大豆蛋白DH较低，发酵液中γ-聚谷氨酸含量也相应较低。直接用大豆蛋白作氮源的培养基（对照1）只能产生少量的γ-聚谷氨酸。这说明大豆蛋白水解物对合成γ-聚谷氨酸的促进作用是源于大豆肽而不是蛋白质或水解物中其它成分。试验所用的枯草杆菌Dg5041可能酶解蛋白能力较弱，对大豆蛋白利用率低，在培养期内生长较缓慢。

相比于使用酵母膏作氮源的普通培养基[9]（对照2），大豆蛋白水解物培养基能更好地促进枯草杆菌Dg5041合成γ-聚谷氨酸，其γ-聚谷氨酸最高水平比普通培养基发酵产量提高106.8%，表现出显著的优势。类似的例子有李玉珍等[4]的报道，以牛肉膏蛋白胨培养基作为参照，大豆蛋白复合酶解产物作为氮源可以提高枯草杆菌的生物量和蛋白酶产量。万春艳等[6]的研究也发现，分子质量不同的大豆肽，其生物学活性不同，在DH 6.37%～19.98%范围内，水解物的促生长活性随着DH的增大而增加，但更高DH水解物的促生长活性反而有所降低。这启示在大豆蛋白水解物的应用中，必须建立适度水解的概念。大豆蛋白DH与枯草杆菌合成γ-聚谷氨酸的关联性及其机理还有待进一步研究。

图5 酶解时间对大豆蛋白水解的影响

表1 大豆蛋白水解物对枯草杆菌合成γ-PGA的影响

3 结论

碱性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶和木瓜蛋白酶在各自优化的酶解条件下对大豆蛋白的酶解效果有较大差异，其中碱性蛋白酶效果最好，其次为中性蛋白酶，酸性蛋白酶和木瓜蛋白酶效果较差。大豆蛋白水解物能显著促进枯草杆菌合成γ-聚谷氨酸，在0.02%～16.44%水解度范围内，大豆蛋白水解度越高，枯草杆菌合成的γ-PGA产量越高。其中，碱性蛋白酶大豆蛋白水解物培养基发酵生产的γ-PGA粗品产量最高，比普通培养基发酵产量提高106.8%。作为一种廉价易得又能高效促进微生物生长发酵的基质材料，大豆蛋白水解物在微生物领域的应用有待广泛而深入的研究。