响应面法优化纤维素酶提取香榧假种皮多酚类物质

冯孝杰，沈倩婷，陈犇，陈俊沲，周瑾，孙小红

绍兴文理学院元培学院（绍兴 312000）

香榧（Torreya grandis）属红豆杉科榧属（Torreya）植物，是中国特有的珍稀坚果树种之一，主要集中分布在长江流域以南海拔300～800 m亚热带山地。浙江省诸暨市香榧栽培产量占全国1/2以上，有“中国香榧之乡”之称[1-2]。香榧籽含油率为546.2～614.7 g/kg，脂肪酸以亚油酸和油酸为主，含有17种氨基酸，19种矿物元素，其中钾、钙、磷、镁等含量高，营养丰富，是一种优质美味坚果[3-5]。香榧假种皮是包裹在香榧种子外面的一层厚的肉质化结构，占种子鲜质量50%～60%。香榧假种皮是香榧加工过程中下脚料，长期被丢弃，腐烂过程造成环境污染。研究发现香榧假种皮中含有醇、醛、酮、烯等20余种芳香成分，可作为提取高级精油的天然优质原料[6-8]。另据报道，香榧假种皮中富含紫杉醇和榧黄素等具有抗病毒和抗肿瘤的活性成分[9-11]。因此开发利用香榧假种皮功能成分，在医药、食品和日用化工等领域有广阔市场前景[12-13]。

试验采用纤维素酶破坏其细胞壁，使香榧假种皮中的多酚类物质充分释放，结合二次通用旋转设计方法，建立以多酚提取率为目标函数的数学模型，重点考察提取温度、pH、料液比和加酶量对多酚得率的影响，为香榧假种皮的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

香榧假种皮（采自浙江省诸暨市）；没食子酸对照品（中国食品药品检定所）；纤维素酶（安徽酷儿生物工程有限公司）；其他所用试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

722 N可见分光光度计（上海仪电科学仪器股份有限公司）；SK 2200 H超声仪（上海科导超声仪器有限公司）；H 1850离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 原料预处理

香榧假种皮经粉碎机粉碎后、过筛、烘干、密封备用。

1.3.2 多酚含量测定

多酚含量测定参照文献采用Folin-Ciocalteu（FC）法[14-15]，采用没食子酸为标准品，制备质量浓度1 mg/mL没食子酸对照品溶液。分别取1，2，3，4和5 mL标准品溶液定容至100 mL。分别取上述溶液1 mL，加入1 mL福林酚试剂，加入8 mL 7.5 g/100 mL碳酸钠溶液混匀，40 ℃水浴保持20 min，波长765 nm，测定吸光度并绘制标准曲线，以没食子酸标准溶液质量浓度为横坐标（X）、吸光度为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得到标准曲线方程Y=0.005 1X+0.004 4，R2=0.997 7。

1.3.3 纤维素酶酶活的测定

1.3.3.1 纤维素酶活测定原理

纤维素酶能够水解羧甲基纤维素（CMC）分子中的β-1, 4葡萄糖苷键，将还原糖释放出来（以葡萄糖计），与3, 5-二硝基水杨酸（DNS）反应产生颜色变化，颜色的变化程度与释放还原糖的量呈正比，在550 nm测得的吸光度对照标准曲线（以葡萄糖为标准物）确定释放还原糖的量，从而计算出纤维素酶活力[16-17]。

1.3.3.2 纤维素酶活力单位定义

1 g酶粉（1 mL酶液）于50 ℃、pH 5.5条件下，1个纤维素酶活力单位定义为每分钟水解1% CMC溶液产生1 μmol还原糖的酶量，计算如式（1）。

纤维素酶活力（U/mL）=A×D/（t×V） （1）式中：A为标准曲线上对应葡萄糖量，mg/mL；D为酶液稀释倍数；t为反应时间，min；V为测定用酶液体积，mL。

1.3.4 单因素试验

考察不同提取方式、温度、时间、pH、加酶量及料液比对多酚提取率的影响，从而确定适宜的提取条件。

1.3.4.1 不同提取方法的考察

选择以50%乙醇为提取溶剂，在浸提温度50 ℃，料液比1∶10 g/mL，浸提时间30 min条件下，分别考察超声波辅助浸提，酶法浸提（pH 5.5，加酶量0.2 mL）及超声波辅助酶法浸提等提取方式，测定吸光度，确定最佳提取方式。

1.3.4.2 提取温度的选择

准确称取2 g香榧假种皮粉末，置于提取容器中，在浸提时间30 min，pH 5.5，料液比1∶10 g/mL，加酶量0.2 mL基础上，分别用超声提取，考察提取温度在40，50，60和70 ℃对提取率的影响，将粗提液经3 500 r/min离心机离心过滤后定容，测定总酚含量，确定最佳提取温度。

1.3.4.3 提取时间的选择

准确称取2 g香榧假种皮粉末，置于提取容器中，在浸提温度60 ℃，pH 5.5，料液比1∶10 g/mL，加酶量0.2 mL基础上，分别用超声提取，考察提取时间为30，45，60和75 min时对提取率的影响，将粗提液经3 500 r/min离心机离心过滤后定容，测定总酚含量，确定最佳提取时间。

1.3.4.4 提取pH的选择

准确称取2 g香榧假种皮粉末，置于提取容器中，在浸提温度60 ℃，浸提时间60 min，料液比1∶10 g/mL，加酶量0.2 mL基础上，分别用超声提取，考察浸提pH为5.0，5.5，6.0和6.5时对提取率的影响，将粗提液经3 500 r/min离心机离心过滤后定容，测定总酚含量，确定最佳提取pH。

1.3.4.5 提取料液比的选择

准确称取2 g香榧假种皮粉末，置于提取容器中，在浸提温度60 ℃，浸提时间60 min，pH 6，加酶量0.2 mL基础上，分别用超声提取，考察料液比为1∶10，1∶12和1∶14 g/mL时对提取率的影响，将粗提液经3 500 r/min离心机离心过滤后定容，测定总酚含量，确定最佳料液比。

1.3.4.6 提取加酶量的选择

准确称取2 g香榧假种皮粉末，置于提取容器中，在浸提温度60 ℃，浸提时间60 min，pH 6，料液比1∶14 g/mL基础上，分别用超声提取，考察加酶量为0.2，0.4和0.6 mL时对提取率的影响，将粗提液经3 500 r/min离心机离心过滤后定容，测定总酚含量，确定最佳提取温度。

1.3.5 样品中总酚得率的测定

取10 mL提取液于离心管中，放入离心机，离心10 min（3 500 r/min）后，精密量取0.2 mL上清液于试管中，用蒸馏水稀释至10 mL，同标准曲线制作相同方法取1 mL稀释样品依次加入1 mL福林酚试剂，8 mL 7.5 g/100 mL的碳酸钠溶液混匀，40 ℃水浴保持20 min，在765 nm处分别测定吸光度，求得样品中总酚含量。总酚得率计算如式（2）。

1.3.6 浸提条件的探讨

在单因素试验所确定的适宜条件范围内，采用二次通用旋转设计，以总酚得率为响应值，通过考察各因素对总酚得率的协同影响，确定最优浸提条件，该设计采用SAS数据处理中响应面进行分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 不同提取方式对香榧假种皮总酚得率的影响

不同提取方式对香榧假种皮总酚得率的影响试验结果见图1。不同提取方式总酚溶出量不同，提取率从小到大依次是超声波浸提、酶法浸提、超声波辅助酶法浸提，且在超声波辅助酶法浸提条件下总酚得率最大，故试验选取超声波辅助酶法浸提。

图1 不同提取方式对总酚得率的影响

2.1.2 提取温度的选择

不同提取方法试验结果见图2。在一定范围内，总酚得率随着温度增加而升高，且在60 ℃时达到最大值，超过60 ℃后由于纤维素酶活性受到抑制，总酚得率出现下降趋势，故选取提取温度60 ℃进行试验。

图2 提取温度对总酚得率的影响

2.1.3 提取时间的选择

不同提取时间试验结果见图3。试验数据显示，最初随着提取时间增加总酚得率有较大幅度增加，但随着时间进一步延长，其增幅慢慢下降，考虑到成本和耗时的综合因素，故选取提取时间60 min进行试验。

图3 浸提时间对总酚得率的影响

2.1.4 提取pH选择

不同pH选择试验结果见图4。试验数据显示，不同pH条件下，总酚得率有个别差异，但总体显示在pH 6左右时总酚得率最高，在大于或小于pH 6情况下总酚得率较低，故选择提取pH 6进行试验。

2.1.5 提取料液比的选择

不同料液比试验结果见图5。试验数据显示，最初随着料液比增加总酚得率有较大幅度增加，但随着料液比进一步增大，其增幅慢慢下降，考虑到成本和效率综合因素，故选取提取料液比1∶14 g/mL进行试验。

图4 不同pH对总酚得率的影响

图5 浸提料液比对总酚得率的影响

2.1.6 提取加酶量的选择

加酶量试验结果见图6。试验数据显示，起初随着加酶量增加总酚得率有较大幅度增加，但随着加酶量进一步增大，其总酚得率增幅渐渐平缓甚至不增长，故认为加酶量饱和，考虑到成本和效率综合因素，故选取提取加酶量0.4 mL进行试验。

图6 不同提取加酶量对总酚得率的影响

2.2 纤维素酶活力测定结果

实测得纤维素酶活力为427 U/mL，稀释10倍用于加样。

2.3 响应模型的建立与分析

2.3.1 试验设计

依据单因素试验结果，综合考虑各因素对香榧假种皮多酚提取率的影响，采用二次通用旋转组合设计法，以香榧假种皮总酚得率为响应值，由于加酶量、浸提时间在继续增加时交互作用不明显，故对温度、pH、料液比这3个因素优化设计，试验安排如表1所示。

表1 二次通用旋转组合试验因素水平表

2.3.2 响应曲面法试验

在单因素试验基础上，在提取溶剂50%乙醇条件下，选取对提取物得率影响较为显著的提取温度（A）、pH（B）、提取料液比（C）作为变量，以香榧假种皮总酚得率（Y）为指标，利用Design-Expert软件进行试验设计与优化，进行三因素三水平试验设计[18-20]。响应面试验设计方案及结果如表2所示。对试验数据进行回归分析，各项回归系数及显著性检验见表3。

香榧假种皮提取物得率与各变量之间的二次方程模型为Y=6.066 25+0.617 63A-4.385 00B+0.876 25C+0.034 500AB-0.010 800AC+0.113 00BC-0.005 225A2+0.120 00B2-0.028 300C2；响应数据的方差分析结果显示模型的F=23.32＞F0.05(9,4)=5.999，p=0.000 2＜0.01，表明回归模型显著，故可用回归方程描述各因子与响应值之间关系。由表3可知方程A、B、C影响极显著，二次项极显著（p＜0.001），说明响应面分析所选的主效应都达到显著水平。其中，因素之间的交互作用也较大（p＜0.05），二次项A2、C2对提取的曲面效应影响极显著，交互项AC、BC交互作用极显著，AB之间交互作用达到显著水平，表明各因素对香榧假种皮提取物得率的影响并不是简单的线性关系。模型中对香榧假种皮提取物得率影响大小顺序依次为B＞A＞C，即pH＞提取温度＞提取料液比。

表2 响应面试验设计及结果

表3 回归方程方差分析

2.4 模型各因素响应曲面及等高线图

响应面及等高线图能够直观地反映出各个因素及其交互作用，利用Design-Expert 8.0.5b软件作出两因素交互作用的响应面及等高线图，结果见图7～图9。

由图7可以看出，在相同料液比下，提取温度和pH对多酚提取率的交互作用。提取pH一定时，随着提取温度增大，多酚提取率呈先上升再下降趋势。温度一定时，多酚提取率随pH升高而增大，而且响应面显示坡度较陡，表明提取温度和超声功率交互作用极显著。

图7 温度和pH对总酚得率交互影响的响应面图和等高线图

由图8可以看出，在相同提取温度下，料液比和pH对多酚提取率的交互作用。提取pH一定时，随着浸提料液比增大，多酚提取率呈先上升再下降趋势。料液比一定时，多酚提取率随pH升高而增大，而且响应面显示坡度较陡，表明提取温度和超声功率交互作用极显著。

图8 料液比和pH对提取物得率交互影响的响应面图和等高线图

图9 料液比和提取温度对提取物得率交互影响的响应面图和等高线图

由图9可以看出，在相同提取pH下，料液比和提取温度对多酚提取率的交互作用。提取温度一定时，随着料液比增大，多酚提取率呈先上升再下降趋势。料液比一定时，多酚提取率随提取温度升高而增大，响应面显示坡度较陡，且超过一定温度呈下降趋势，表明提取温度和超声功率交互作用极显著。

2.5 最优条件的确定与验证

对所得模型回归方程取一阶偏导数等于零，整理可得到式（4）～（6）。

联立解得A=59.45 ℃、pH 6.45、C=1∶17.31。因此根据响应面分析结果预测香榧假种皮提取物提取最优工艺条件为：提取温度59.45 ℃，pH 6.45，料液比1∶17.31 g/mL。在此工艺条件下预测多酚得率为22.45 mg/g。为检测响应曲面法所得结果的可靠性，采用优化条件进行重复试验，在优化条件下实际提取率为20.73%。与预测值相比，其相对偏差约1.79%，说明可以利用回归方程对实际浸提进行预测和控制。因此，基于响应曲面法所得的优化工艺参数准确可靠，具有实际价值。

3 结论

香榧假种皮多酚提取物的最优提取工艺在单因素试验基础上，选取对提取物得率影响显著的提取温度、提取pH、料液比作为Box-Behnken试验设计变量，以香榧假种皮多酚提取得率为响应值，对香榧假种皮提取物的提取工艺进行优化，得出最优工艺为：提取溶剂采用50%乙醇、酶0.4 mL（42.7 U/mL）、提取温度59.45 ℃、pH 6.45、料液比1∶17.31 g/mL。在此条件下提取物多酚得率为22.45 mg/g。