弓形虫Tgcsp 2基因敲除株的表型和毒力

牛美容,李法财,谢世臣,聂兰碧,朱兴全,赵光辉∗ (.西北农林科技大学 动物医学院,陕西 杨凌700;.中国农业科学院 兰州兽医研究所/家畜疫病病原生物学国家重点/甘肃省动物寄生虫病重点实验室,甘肃兰州730046)

刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种专性细胞内寄生原虫,能够引起人兽共患的弓形虫病。孕妇在怀孕期间感染弓形虫后,可通过垂直传播引起胎儿脑炎、视网膜炎症甚至更严重的后果[1-2]。弓形虫的宿主范围广泛,能够感染包括人在内的几乎所有的温血动物,在宿主中能够入侵所有有核细胞并且在其中生长复制[3]。弓形虫以孢子化卵囊、包囊和速殖子3种形式感染宿主[4]。其中感染宿主细胞需经过入侵、复制和逸出3个过程,当宿主免疫力低下时,能够引起发烧、肺炎和心肌炎等症状[1,5]。

冷休克结构域(cold shock domain,CSD)是一种高度保守的核酸结合域,而且在细菌、植物和动物中普遍存在[6]。冷休克蛋白(cold shock proteins,CSPs)在结构上含有1个或多个CSD,且在细菌和植物中的生物学功能是保守的,均参与冷应激的调节[7-8]。细菌的CSPs由单个CSD 构成并具有RNA分子伴侣的活性,在细菌受到冷应激时,能够稳定RNA 的二级结构[9]。在植物拟南芥中,冷休克蛋白AtCSP2参与调节冷应激反应,而且AtCSP2 和AtCSP4在拟南芥的生长发育过程中起重要作用[8,10]。在脊椎动物中,YB-1蛋白是典型的且研究最多的冷休克蛋白,参与转录和翻译过程,在应激反应、细胞增殖和DNA 修复中均具有重要的作用[11]。

尽管CSPs在细菌、植物以及动物中都具有重要的生物学功能,但是在弓形虫上还没有相关研究。基于此,本研究利用CRISPR/Cas9 基因编辑技术获得弓形虫Tgcsp2基因敲除株,并通过体内外试验探究Tgcsp2在弓形虫中的作用。

1 材料与方法

1.1 试验材料SPF 级别雌性BALB/c小鼠购自中国农业科学院兰州兽医研究所实验动物中心;大肠杆菌DH5α感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司;人包皮成纤维(human foreskin fibroblast,HFF)细胞和弓形虫RH 株(本实验室保存);pSAG1::Cas9-U6::Sg UPRT 和p UPRT::DHFRD 质粒由华中农业大学申邦教授馈赠。

结晶紫染色液、5%BSA 封闭液、4%多聚甲醛溶液购自北京索莱宝科技有限公司;鼠抗弓形虫SAG1单抗、Alexa Fluor®488标记的兔抗鼠IgG 抗体、Alexa Fluor®594 标记的兔抗鼠IgG 抗体购自Abcam 公司;Primer Star GXL DNA 聚合酶购自大连宝生物工程有限公司;细胞/组织/血液基因组提取试剂盒、质粒小提试剂盒和DNA 纯化回收试剂盒购自北京天跟生化科技有限公司。

1.2 细胞和虫株培养人成纤维包皮细胞培养于含10% 胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的DMEM 培养液中,培养条件为37℃,5%CO2。弓形虫RH 株速殖子通过传代方式培养于HFF 细胞中,当80%以上HFF细胞发生裂解时,收集细胞及胞外虫体并破碎细胞,将其通过孔径为3～5μm 的滤膜进行过滤,将纯化后的细胞继续接种于HFF细胞中传代培养。

1.3 Tgcsp 2 基因敲除株的构建参考CRISPR/Cas9弓形虫基因编辑方法[12],根据Tgcsp2的基因序列(TGME49_267470),在E-CRISP (http://www.e-crisp.org/E-CRISP/designcrispr.html)网 站上获取Tgcsp2基因的sg RNA 序列。以pSAG1::Cas9-U6::sg UPRT 质粒为模板,Tgcsp2-g RNAFw(5′-GTGAATGTCACCGGTCCAAAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3′)和Tgcsp2-gRNA-Rv(5′-AACTTGACATCCCCATTTAC-3′)为 上、下游引物,根据Q5定点突变试剂盒的说明构建靶向Tgcsp2基因的CRISPR/Cas9质粒(pSAG1::Cas9-U6::sg TgCSP2)。以p UPRT::DHFR-D 质粒为模板,DHFR-F(5′-CAGGCTGTAAATCCC-GTGAG-3′)和DHFR-R(5′-GATTCCGTCAGCGGTCTGTCA-3′)分别为上、下游引物,PCR 扩增DHFR∗抗乙胺嘧啶药物标记,将PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后,切胶回收。将pSAG1::Cas9-U6::sgTgcsp2质粒和DHFR∗抗性标记通过电穿孔的方法转入弓形虫RH 速殖子。经乙胺嘧啶筛选获得ΔTgcsp2阳性单克隆虫株后,用引物Tgcsp2-KO-Fw(5′-GTCACACGTCATGCCAGCAG-3′)和T-gcsp2-KO-Rv(5′-GAAGCGTCCTTCTTGTCG-TC-3′)进行PCR 鉴定。

1.4 空斑和裂解试验将纯化后的弓形虫速殖子用含有2%FBS的DMED 培养液稀释至1×103/m L,然后取200μL(～200个/孔)加入长满HFF细胞的6孔板中,在37℃,5% CO2条件下静置培养8 d。去掉上清并用PBS 洗涤后,75%乙醇室温固定20 min,0.2%结晶紫溶液染色30 min,然后将染液弃掉,PBS将染液洗去,待其自然晾干后,于倒置显微镜下观察计数并扫描空斑结果。试验设置3个重复。

将纯化的速殖子按每孔1×106,5×105,1×105,5×104,1×104的剂量接种于长满HFF 的96孔板中,未接种速殖子的孔作为空白对照。将其置于细胞培养箱中72 h后,按照空斑试验的方法进行结晶紫染色,PBS洗涤后,待其自然晾干。将96孔板放于酶标仪中,读取波长为630 nm 时的吸光度值,根据吸光度值计算细胞裂解率[13]。试验设置3个重复。

1.5 入侵试验将自然逸出的弓形虫速殖子纯化后按1x105/孔的剂量接种于长满HFF 细胞的6孔板中,将其在细胞培养箱中放置4 h。PBS 轻轻洗去游离于上清的虫体后,4%甲醛溶液固定20 min,5%BSA 封闭1 h,加入鼠抗弓形虫SAG1单克隆抗体并37℃孵育2 h,然后加入Alexa Fluor®594标记的兔抗鼠多克隆抗体,37℃孵育2 h用于细胞外速殖子的染色。0.2% Triton X-100将细胞膜进行穿透30 min后,按照上述同样的方法,将细胞内的速殖子用Alexa Fluor®488标记的兔抗鼠多克隆抗体进行孵育染色。50%甘油进行封片后,将6孔板置于荧光显微镜中观察并统计[14]。试验设置3个重复,每个重复计数约100个虫体。

1.6 胞内复制试验纯化的弓形虫速殖子感染HFF细胞24 h后,PBS洗去细胞外的虫体,4%甲醛 溶 液 固 定20 min,0.2% Triton X-100 穿 透30 min,5%BSA 封闭1 h。加入鼠抗弓形虫SAG1单克隆抗体于37℃孵育2 h,然后加入Alexa Fluor®594标记的兔抗鼠抗体于37℃孵育2 h。50%甘油封片,将其置于荧光显微镜下观察并统计。试验设置3个重复,每个重复统计100个纳虫泡。

1.7 逸出试验将纯化的弓形虫速殖子按每孔1×106的剂量接种于长满HFF 细胞的6孔板中,置于37℃,5% CO2条件下培养48 h。PBS清洗3次以除去细胞外的速殖子,加入10 mmol/L的二硫苏糖醇诱导速殖子逸出细胞[15],并设置空白对照。诱导5 min后,按照入侵试验中的红—绿双染方法区分细胞内外的速殖子。并于荧光显微镜下拍照记录。

1.8 毒力试验将5～6周龄的雌性BALB/c小鼠随机分组,每组6只,并且适应环境1周。腹腔注射弓形虫速殖子(100 个/只)。每天观察小鼠的活力,并记录小鼠死亡时间及个数。

1.9 统计学分析使用GraphPad Prism 5.0软件中的T检验方法对统计结果进行分析,数据结果由±s x表 示。统计学差异情况表示为:∗P＜0.05;∗∗P＜0.01;∗∗∗P＜0.001。

2 结果

2.1 ΔTgcsp2 虫 株 的 获 得 将pSAG1::Cas9-U6::sgTgcsp2 质粒和DHFR∗抗性标记转入弓形虫RH 速殖子之后,CRISPR/Cas9系统使靶基因在sg RNA 序列处发生双链断裂(double-strand DNA breaks,DSB),并通过非同源末端连接的方式将大小为3 216 bp的DHFR 片段插入断裂区域,使得靶基因的结构被破坏。药物筛选获得有抗性的单克隆虫株,在sgRNA 上、下游设计引物并通过诊断PCR鉴定DHFR∗是否插入到正确的位置。鉴定结果显示在sgRNA 处有DHFR 片段插入(图1)。

图1 ΔTgcsp 2虫株的构建与鉴定 A.利用CRISPR/Cas9系统和非同源末端连接方法构建ΔTgcsp 2虫株的原理图;B.PCR 鉴定阳性ΔTgcsp 2单克隆虫株;1.DL5000 DNA Marker;2.RH:ΔTgcsp 2;3.RH

2.2 ΔTgcsp 2虫株的体外生长能力检验通过空斑试验和细胞裂解试验检测ΔTgcsp2虫株的体外生长能力(图2)。ΔTgcsp2虫株和RH 野生株均能形成空斑,但是ΔTgcsp2虫株形成的空斑较RH 野生株更小且数量较少。细胞裂解结果显示,当感染剂量为1×105或5×104时,ΔTgcsp2虫株裂解细胞的能力低于RH 野生株,当感染剂量为5×105时,2个虫株间的细胞裂解能力差异极显著,感染剂量为1×106时,ΔTgcsp2和RH 株几乎将所有细胞全部裂解。

图2 空斑试验和细胞裂解试验探究ΔTgcsp 2虫株的体外感染能力 A.ΔTgcsp 2虫株与RH 野生株形成的空斑个数和大小的对比结果;B.不同感染剂量下ΔTgcsp 2虫株与RH 野生株对HFF细胞的裂解程度

2.3 ΔTgcsp 2虫株的入侵率检测通过红-绿双染方法可以将细胞内外的速殖子区分,其中Alexa Fluor®594标记的二抗使细胞外的速殖子在荧光显微镜下呈红色,Alexa Fluor®488标记的二抗使细胞内外所有的速殖子在荧光显微镜下呈绿色,而叠加之后为橙色的速殖子即为细胞内虫体。细胞内的速殖子与所有速殖子个数的比值即为虫体的入侵率,统计结果显示,ΔTgcsp2 虫株的入侵率明显小于RH 野生株(图3)。

图3 红-绿双染试验检测ΔTgcsp 2 虫株的入侵率 A.荧光显微镜下观察ΔTgcsp 2 虫株与RH 野生株的入侵情况;B.ΔTgcsp 2虫株与RH 野生株的入侵率统计结果

2.4 ΔTgcsp 2虫株的胞内复制能力检验为探究ΔTgcsp2虫株在细胞内的增殖能力,用Alexa Fluor®594标记的二抗孵育细胞内的虫体,使其在荧光显微镜下呈红色。计数100个纳虫空泡,并统计含有1,2,4,8 个速殖子的纳虫泡个数。统计结果显示,ΔTgcsp2虫株中含2个速殖子的纳虫泡明显多于RH 野生株,而含有8个速殖子的纳虫泡个数明显少于RH 野生株,含有1和4个速殖子的纳虫泡个数在ΔTgcsp2虫株和RH 株中无统计学差异(图4)。

2.5 ΔTgcsp 2虫株的逸出能力检验通过红-绿双染方法将细胞内外的速殖子区分,从而可以在荧光显微镜下观察到虫体的逸出情况,染色情况同入侵试验。结果显示,二硫苏糖醇诱导5 min后,RH 野生株的速殖子全部逸出,而ΔTgcsp2虫株只有部分逸出(图5)。

图4 ΔTgcsp 2虫株在HFF细胞内的复制能力 A.荧光显微镜下观察ΔTgcsp 2虫株和RH 野生株纳虫泡内速殖子分布情况;B.纳虫泡内速殖子个数为1,2,4,8的荧光图;C.ΔTgcsp 2虫株和RH 野生株内含速殖子为1,2,4,8的纳虫空泡个数与总纳虫泡个数的比值

图5 二硫苏糖醇诱导ΔTgcsp 2虫株和RH 野生株速殖子的逸出情况 A.诱导之前虫体的分布情况;B.诱导5 min后虫体分布情况

2.6 ΔTgcsp 2虫株对小鼠的毒力检验将纯化的ΔTgcsp2虫株和RH 野生株等剂量感染6～7周龄BALB/c小鼠。结果发现,RH 虫株感染的小鼠在第9天开始死亡,10 d内全部死亡。ΔTgcsp2虫株感染的小鼠在感染后23 d内全部死亡(图6)。

图6 等剂量的ΔTgcsp 2 虫株和RH 野生株速殖子感染BALB/c小鼠存活率

3 讨论

通过NCBI数据库检索弓形虫TgCSP2蛋白结构,CD Search 结果显示,TgCSP2 蛋白含有1 个CSD 保守域,该结构位于第74～127个氨基酸之间且具有DNA 结合的特性,本研究中sgRNA 序列位于该保守域。此外,检索结果还表明,TgCSP2的结构与蜡样芽胞杆菌的Csp C 蛋白以及真核生物的YB蛋白相似,两者均在生物体转录和翻译调节中发挥作用[11,16]。YB-1是研究最多的YB蛋白,与细胞迁移、增殖和炎性反应有关,此外,将小鼠的YB-1基因敲除后会引起胚胎致死[17-18]。

本研究中Tgcsp2 基因片段大小为1 051 bp,将片段大小为3 216 bp的DHFR∗插入到该基因的CSD 区域可以破坏该基因的结构及CSD 保守域的功能。如图1 所示,将含有靶基因sgRNA 序列的CRISPR/Cas9 质粒转入虫体后,Cas9 蛋白会在sg RNA 的引导下将Tgcsp2基因中与sg RNA 结合的序列断裂,DNA 发生双链断开后,机体启动DNA修复功能。DNA 修复DSB的机制包括同源重组和非同源末端连接,而在弓形虫野生株中更容易发生非同源末端连接的修复机制,因此,本研究将DHFR 片段利用非同源末端连接的修复机制插入到Tgcsp2基因中[12]。上述试验结果表明,ΔTgcsp2虫株的入侵能力减弱,在HFF细胞内的增殖能力相对于RH 株较慢,这些结果与空斑试验的结果一致,空斑大小表示虫体的复制能力,空斑的数量表示虫体的入侵能力。逸出试验结果表明,ΔTgcsp2虫株逸出细胞的能力相对于RH 株较慢。虫体对宿主细胞的裂解程度与虫体入侵、复制和逸出能力有关。本研究表明,ΔTgcsp2虫株体外入侵、胞内复制以及逸出能力的下降共同导致其细胞裂解能力的降低。小鼠毒力试验结果表明,感染ΔTgcsp2虫株的小鼠比感染RH 虫株的小鼠存活时间更长,说明ΔTgcsp2虫株在小鼠体内的扩散能力减弱,这一结果与ΔTgcsp2虫株体外表型研究结果相一致。

弓形虫热休克蛋白Tg HSP90是1个高度保守的分子伴侣,将弓形虫Tghsp90基因敲除后,虫体的入侵能力以及对小鼠的毒力下降,复制能力完全丧失[19-20]。本研究将Tgcsp2 基因敲除后,虫体的表型与ΔTghsp90的表型相似,但是ΔTgcsp2虫株的复制能力仍然保留。TgCSP2蛋白在结构和功能上均与YB-1 蛋白相似,与Tg HSP90 在功能上相似。因此,推测TgCSP2具有分子伴侣活性,但是具体的分子机制还需进一步研究证明。

总之,本研究证明了Tgcsp2基因对弓形虫体外感染宿主细胞的影响,而且证明该基因能够减弱弓形虫在小鼠体内的毒力。这些数据将为阐明csps在虫体发育中的作用特性以及探究TgCSP2蛋白的作用机制奠定了基础。