迁徙候鸟产气荚膜梭菌的分离鉴定与特性分析

司 南,祝令伟,景 洁,梁 冰,王 莹,纪 雪,郑 林,陈 萍,郭学军∗ (.吉林农业大学 食品科学与工程学院,吉林 长春308;.军事医学科学院 军事兽医研究所/吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室,吉林 长春30)

产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens),又称产气芽孢杆菌、厌氧芽孢杆菌或魏氏梭菌,是一种革兰阳性产芽孢杆菌[1]。在自然界中以芽孢形式存在,机体内可形成荚膜。产气荚膜梭菌广泛分布于土壤、食物、污水、粪便及许多健康人和动物的肠道中[2]。在特定条件下该菌的大量繁殖可引起人类和各种动物发病,引起创伤性感染、恶性水肿、气性坏疽、坏死性肠炎、厌氧性蜂窝织炎、肠毒血症、产后分娩败血症等感染性疾病。已知产气荚膜梭菌可分泌超过20种外毒素[3],基于其产生的主要致死性毒素α、β、ε和ι毒素的差异,将产气荚膜梭菌分成A、B、C、D 和E型共5种毒素型,所有毒素型均能造成人类或动物感染,引起组织损伤[4],其中A 型最容易引起人食物中毒,产气荚膜梭菌性食物中毒是主要的食源性疾病之一[5]。细菌生物被膜(BBF)[6]是指由附着于惰性或者活性实体表面的细菌细胞和包裹着细菌的由细菌自身所分泌的含水聚合性基质所组成的结构性细菌群落。生物被膜不仅是细菌存在于自然界的一种重要的生存形式,而且生物被膜的形成是细菌对抗生素广泛耐药的重要机制之一[7]。在食品加工的过程中,通常用不锈钢、铝面板等设备,其表面具有微细的沟槽和缝隙,更容易滋生细菌,从而形成生物被膜[8]。抗生素耐药细菌的感染会导致动物及人类的呼吸道和肠道疾病,严重者致死,美国每年因此造成的死亡人数高达23 000人,至少500亿美元用于医疗花费和消耗损失[9]。2016年,刊登于英国著名医学期刊《柳叶刀传染病》上的1篇关于细菌耐药机制在动物和人类中出现的报道指出,一些细菌对药物的耐药不断打破抗生素防线[10]。

本研究从多地区采集的迁徙候鸟样品中分离鉴定产气荚膜梭菌,并进行分型、检测其携带毒力基因的情况和生物膜形成能力,探讨迁徙鸟类携带该病原菌通过环境和食物链传播疾病的风险;并对分离菌株的耐药性进行分析,了解耐药菌在其中的流行情况。

1 材料与方法

1.1 试验材料PCR Master Mix 缓冲液、DNA Marker等PCR 相关试剂为Ta KaRa 公司产品;PCR 引物合成和测序均由吉林省库美生物有限公司完成;抗生素药敏检测E-test Strip(包括四环素、复方新诺明、氨苄西林、环丙沙星、莫西沙星、杆菌肽、黏菌素、克林霉素、红霉素和氯霉素共10种药敏检测试纸条)为法国梅里埃(Biomerieux)公司产品。

1.2 培养基药敏试验使用MH 培养基,购自法国梅里埃公司,细菌培养基及其添加成分和厌氧产气袋等购自青岛海博生物公司。细菌分离培养使用胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸(TSC)琼脂平板,增菌培养使用液体硫乙醇酸盐培养基(FTG)并添加5%无菌脱纤维绵羊血,按照产品说明书配制。

1.3 菌株产气荚膜梭菌标准菌株ATCC 13124由本室保存,为毒素A 型。

1.4 粪便样品采集和处理家禽类粪便样品的采集:粪便发酵池或自然堆肥,随机选5点,剥离表层20 cm 粪便弃去,采集深层粪便样本100 g/份(带乳胶手套,外层带一次性塑料手套,用手抓取,然后将一次性手套翻转,连手套放入自封袋),运输途中加冰袋保证低温,实验室内－20℃冻存。

候鸟类粪便样品的采集:根据候鸟迁徙规律,在重要栖息地候鸟大规模聚集、停留的时间段采集样品,首先使用望远镜远距离观察鸟群,记录候鸟种类,使用无菌棉拭子蘸取新鲜粪便放入含有1 m L生理盐水保存液的离心管中,样品放置在采样箱中冷链运送。在实验室内将采样管混合震荡至均匀后,自然沉降2 min,取上层悬液分离细菌。

1.5 病料样品采集和处理采集死亡时间1 d以内、个体保存完整,观察体表无明显溃烂和伤口的死亡鸟类,放置在采样箱中冷链运送。在生物安全柜中采取组织样品,将动物仰卧,腹部去毛,用酒精棉擦拭腹部,从两侧剪开,取出完整的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏,分别放置于平皿中,取病变部位肠段置于平皿中。

1.6 产气荚膜梭菌的分离培养及鉴定参照国家标准《食品卫生微生物学检验—产气荚膜梭菌检验GB/T 4789.13》进行细菌的分离培养,并结合PCR方法鉴定。粪便样品:吸取悬液50μL,接种于5 m L的FTG 增菌液中,37℃培养8～12 h后在TSC 琼脂平板划线,37℃厌氧罐培养16～18 h;脏器样品:用酒精棉球对脏器表面进行消毒,剪开待检脏器,接种环从切面蘸取渗出物,在TSC琼脂平板划线。

挑取TSC 琼脂平板上生长的黑色菌落接种FTG 增菌液,37℃培养8～12 h。观察产气情况,革兰染色镜检,然后进行PCR 鉴定。PCR 阳性的增菌液,使用TSC琼脂平板进行2次纯化,再次挑取黑色菌落接种增菌并进行PCR鉴定,然后保存菌种。

1.7 引物合成参考相关文献[11-12]合成用于产气荚膜梭菌鉴定和毒素分型的引物(表1)。

1.8 多重PCR 鉴定菌株的毒素型参照YOO等[11]的方法进行多重PCR 鉴定菌株的毒素型,其中仅有α毒素为A 型,含α、β、ε毒素为B型,α、β毒素为C型,α、ε毒素为D 型,α、ι毒素为E 型。PCR反应体系为25.00μL 包括:2×PCR Master Mix 12.50μL,引 物(10 nmol/L)每 条0.25μL,模 板DNA 2.00μL,蒸馏水补足25.00μL。扩增条件:95℃预变性1 min;94℃变性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s,循环35次;72℃再延伸5 min,冷却至4℃。PCR 完成后,1%琼脂糖凝胶电泳,观察结果并拍照。

1.9 生物被膜形成测定挑取在TSC 琼脂平板上生长状态良好的新鲜黑色菌落,接种TGY 肉汤(3.0%胰蛋白胨,2.0%葡萄糖,1.0%酵母膏和0.1%半胱氨酸)中37℃厌氧培养24 h。按照1∶10比例重新接种TGY肉汤,聚苯乙烯培养板上37℃厌氧培养24 h。培养后,去除培养基,用1%PBS洗涤2次,去除浮游细菌。用结晶紫(CV)法测定生物膜的形成,每孔用1%CV 溶液染色,室温下孵育10 min。经1%PBS充分洗涤后,乙醇孵育15 min,用微孔板读数仪测定595 nm 处的吸光度[13]。每个菌株设3个重复孔,同时设阳性对照和空白对照,使用空白对照调零,平均D值＞0.2判为阳性。

表1 产气荚膜梭菌鉴定引物

1.10 耐药性分析参照美国临床和实验室标准化协会(clinical laboratory standards institute,CLSI)推荐的方法[14],测定抗生素的最小抑菌浓度(MIC值),使用金葡菌ATCC 29213作为对照菌株。挑取MHⅡ琼脂平板上纯化的细菌培养物,MH 液体培养基稀释至0.5麦氏比浊度,然后用灭菌棉签蘸取菌液,均匀涂抹于MHⅡ琼脂平板,贴上Biomerieux公司的E-test药敏检测试纸条,37℃厌氧培养14～16 h观察结果,根据读数判断耐药(R)中介(I)和敏感(S)。

2 结果

2.1 产气荚膜梭菌分离鉴定经过TSC 平板分离培养后,挑取黑色的单菌落,PCR 鉴定α毒素阳性的菌株判定为产气荚膜梭菌。粪便样品采集信息以及细菌分离鉴定的结果如表2所示。从549份迁徙候鸟的粪便中共分离出42株产气荚膜梭菌,总分离率7.7%;同时,从长春某大型蛋鸡场采集粪便41份,分离菌株14株,分离率为34.2%。

表2 粪便样品采集信息以及细菌分离鉴定结果

从3次野生候鸟死亡的疫情[15]中共采集35只保存完整的个体,其中从吉林松花江1只、内蒙古乌梁素海和达里湖各2只死亡鸟类的组织病料样品中共分离出11株产气荚膜梭菌(表3)。

2.2 细菌毒素分型和主要毒力基因鉴定参照YOO 等[11]的多重PCR 方法鉴定分离菌株的毒素型,根据PCR 鉴定的结果:从广西南宁夜鹭分离1株E 型菌,从广西北海鸻鹬类分离2株E 型,从吉林松花江死亡鸟类病料组织分离2株E 型菌(肺脏和病变肠道分离各1株),候鸟粪便和组织病料样品中分离菌株均为A 型菌;所有养鸡场分离菌株均为A 型。A 型菌株仅α毒素基因为阳性,E 型菌株α和ι毒素基因为阳性(图1)。鉴于E 型菌没有阳性对照菌株,将ι毒素基因的PCR 扩增产物进行测序分析,通过BLAST 比对证明5株E 型菌的测序结果全部与已知E 型菌株[16]pCPPB-1质粒上(NCBI登陆号AB604032.1)ι毒素基因的同源性在99%以上,证明本研究分离菌株中确实携带ι毒素基因。通过PCR 鉴定另外的3种重要毒素基因(肠毒素、β2毒素和NetB毒素),所有分离菌株均为阴性。

表3 死亡鸟类病料样品中细菌分离鉴定结果

图1 产气荚膜梭菌分离株毒素分型的多重PCR 鉴定 1～4.E 型 分 离 株;5～8.A 型 分 离 株;9.A 型 标 准 菌 株ATCC13124;10.阴性对照;M.DL1500 DNA Marker

2.3 生物被膜的形成通过结晶紫染色定量法,测定分离到的53株候鸟源菌株生物被膜形成能力,经测定,有30株菌株能够在聚苯乙烯培养板上形成生物被膜,经CV 染色后,形成生物被膜的细菌培养孔吸光度值远高于对照孔。使用空白对照调零后,阳性对照平均值为0.873,检测生物被膜阳性的各菌株平均D值(图2)。

图2 生物被膜形成测定结果 1～30.产气荚膜梭菌分离株;31.标准菌株ATCC13124;N.空白对照组

表4 候鸟分离产气荚膜梭菌的耐药性分析

2.4 耐药性分析测定53株候鸟源菌株对10种抗生素的MIC值,根据CLSI对厌氧梭菌类细菌的耐药性判定标准,统计敏感和耐药率的结果如表4所示。CLSI没有给出梭菌类对黏菌素的耐药性判定标准,但是本次检测所有菌株的MIC值都超过试纸条的检测范围(≥256 mg/L),因此判定所有菌株均为耐药。其中,共有5株菌株对超过5种以上的抗生素具有耐药性,可被认为是超强耐药菌(表4)。

3 讨论

目前,我国因感染产气荚膜梭菌引起人类食物中毒的病例报道比较少,缺乏详细的流行病学统计资料,但由于卫生条件和饮食习惯等因素,产气荚膜梭菌仍是一种不可忽视的致病菌,也引起世界范围内的广泛关注,其对食品安全和公共卫生都是严峻的威胁,国内外对该病原菌在人的感染以及各种家养畜、禽中感染流行的情况都有很深入的研究[4-5,12-14],但是极少有人关注其在野生动物中的感染流行情况。

本研究从全国多地区采集野生鸟类的粪便和病料样品,对菌株进行分离鉴定。同时,为验证分离鉴定方法的准确性,从长春某大型蛋鸡场采集粪便进行细菌的同步分离鉴定。因为产气荚膜梭菌本身是许多健康人和动物肠道中的常在菌[12-13],畜禽养殖场因为其集约化水平高、通风性差,又为病原菌的隐藏、孽生提供了场所;而本次采样时间在冬季,养殖场为了保温而忽视通风,更是为细菌的传播提供便利,本次在鸡场的分离率较高为34.2%。相比之下,野生鸟类的分离率就比较低,从549份粪便样品中分离出42株产气荚膜梭菌,总分离率为7.7%。采集的粪便样品涉及多种类型的候鸟,包括雁鸭类、鹭类、鸬鹚和鸻鹬类等,不同的鸟类细菌分离率也有所不同,其中雁鸭类总分离率3.0%,而鹭类和鸬鹚总分离率为12.9%。这可能和不同鸟类的觅食习性和栖息环境等相关,雁鸭类以植食性为主,主要栖息在大的河流和湖泊等远离人类生活区的地方;而鹭类主要觅食鱼虾和甲壳类等动物性食物,往往在农田、鱼塘甚至人类的生活区觅食,因此产气荚膜梭菌的分离率要高于雁鸭类。而从广东肇庆星湖保护区人工饲养的丹顶鹤粪便样品中细菌分离率最高(34.6%),也说明鸟类携带产气荚膜梭菌的情况与人类接触密切相关。

因为候鸟属于长距离迁徙的野生动物,在迁徙过程中通过各种途径接触病原菌,有可能通过多种途径传播给人类和家养畜禽,比如与禽类的直接接触、空气传播、排泄物对水源和水产品的污染等,由此引发的食品卫生和公共安全问题都值得关注。本研究还从吉林松花江等野生鸟类大批死亡疫情中分离出产气荚膜梭菌,分离到该菌株的死亡鸟类表现不同程度的肠道水肿、出血和多脏器组织坏死、出血等症状,与动物产气荚膜梭菌引起的肠毒血症类似[3,12],说明产气荚膜梭菌也能够引起野生鸟类的感染和死亡。

对所有分离株进行毒素基因分型,A 型分离率高达90.0%以上,A 型产气荚膜梭菌可导致人和动物气性坏疽以及牛、马、禽类等坏死性肠炎,被该菌污染的禽肉和蛋存在食品安全隐患[13]。另外还有5株E型菌,E型菌株可引起羔羊、犊牛和家兔患肠毒血症并急性死亡[17],E 型产气荚膜梭菌首次被发现在2013年,KIM 等[18]从腹泻而死的仅仅2日龄的小羊小肠内分离得到。在我国,由于各个地区存在着区域性和季节性的差异,据张成林等[19]统计,春季时发病率最高的地区基本为西部地区、黄河以北和黄河长江间,夏季发病率最高的地区为长江以南,统计结果显示,从北向南,发病率呈下降趋势。由迁徙候鸟携带并引起鸟类感染死亡的报道在国内外都属于首例。本试验中未鉴定出B、C和D 型菌株。

除了毒素基因分型的α、β、ε和ι毒素之外,产气荚膜梭菌还有另外一些重要的毒素,如β2 毒素(cpb2基因编码),其与β毒素具有相似的生物学活性,也是具有细胞毒性和致死性的一种强毒素[20-22];NetB毒素,是2008年在A 型产气荚膜梭菌感染的坏死性肠炎病鸡体内首次分离到的1种新毒素,它能使宿主细胞形成1.6～1.8 nm 亲水性的孔洞,最终导致细胞破裂[23];肠毒素(cpe基因编码),是引起气荚膜梭菌性食物中毒腹泻和呕吐症状的一个非常重要的原因,严重时,毒素(或细菌与毒素)可进入血液循环,引起毒血症(或败血症),从而导致机体全身衰竭、死亡[24]。这些毒素在病原菌感染过程中都能够发挥重要作用,但是本研究分离菌株均未检测到这些毒素。

本研究还对分离菌株耐药性的情况进行分析,结果显示,候鸟携带菌株的耐药性也非常严重。其中,对黏菌素的耐药率达到100%,因为未见相关报道,推测产气荚膜梭菌对黏菌素为天然耐药。其次为红霉素、克林霉素和杆菌肽,耐药菌的比例都在40%以上;而对氯霉素、复方新诺明、氨苄西林、环丙沙星、莫西沙星耐药的情况较轻,敏感菌所占的比例在70%以上。有5株菌对超过5种以上的抗生素具有耐药性,可认为是超强耐药菌。

耐药菌的传播将会给人产气荚膜梭菌感染的治疗带来很大压力,造成抗菌药物治疗效果下降,疾病迁延不愈等后果,严重威胁人类健康,产生公共安全的隐患。因此,了解产气荚膜梭菌的污染源,分析传播途径和耐药性,对预防和临床治疗具有重要意义。同时应避免滥用抗生素,否则会导致病原菌获得不同程度的抗药性,给细菌性疾病防治带来困难,也会对食品安全和人类健康带来风险。