大黄素干预慢性压迫性损伤模型髓鞘蛋白表达的研究❋

陈 鹏，王 琛，张 冕，渠景连，王文静，吴智兵,3△

(1.贵州中医药大学，贵阳 550025；2.广州中医药大学，广州 510405；3.广州中医药大学第一附属医院，广州 510405)

神经病理性疼痛(neuropathic pain,NP)在普通人群中患病率约为6.9%～10%[1]，其造成的异常性疼痛、痛觉过敏及自发性疼痛严重影响患者的日常生活及行为功能，给社会造成巨大的经济和医疗负担[2-4]。目前治疗NP的抗癫痫、抗焦虑及阿片类药物临床效果有限，存在头晕、嗜睡甚至引发心律失常等严重不良反应[5-7]。大黄素为中药大黄的主要有效成分，属于天然的蒽醌类衍生物。在前期研究中我们发现，中剂量(50 mg/kg)大黄素能显著改善神经病理性疼痛CCI模型实验大鼠自发性疼痛，缓解机械及热痛觉过敏表现[8]。事实上，外周神经损伤后引发华勒氏变性并启动自我破坏程序是NP形成的重要原因，同时近年来越来越多研究认为大黄素能够通过干预多种不同的信号通路，从而在神经系统疾病形成过程中发挥神经保护作用[9]。故本实验拟探究大黄素干预下CCI大鼠脊髓组织中MBP、MPZ表达情况，明确大黄素是否通过调节髓鞘再生作用达到缓解疼痛的效果。

1 材料与方法

1.1 试剂及仪器

SPF级7周龄雄性大鼠30只，由广州中医药大学动物实验中心提供，生产许可证号SCXK(粤)2013-0034。动物饲养于广州中医药大学第一附属医院SPF级动物实验室。本实验已通过广州中医药大学第一附属医院动物使用与伦理委员会审查。一抗MBP兔抗、MPZ兔抗以及山羊抗兔二抗均购自美国Proteintech公司，货号分别为10458-1-AP、10572-1-AP、12472-1-AP、SA00001-2；PCR反应所需试剂SYBR©Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)购自日本TAKARA公司。本实验所用热辐射测痛仪器、Von Frey电子测痛仪购自美国IITC-Life Science公司；伯乐ChemiDocTMMP全能型成像系统以及7500PCR仪购自美国Bio-Rad公司。

1.2 动物模型与分组

将30只SD大鼠按照随机数字表法分为假手术组、CCI组及大黄素组各10只，按照Bennett和Xie创立的手术方法制作CCI模型[10]。术前各组大鼠腹腔注射戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉，切开其左下肢中段皮肤，逐层分离肌肉后暴露坐骨神经，用4-0丝线在坐骨神经主干做4道结扎，间距为1～2 mm，力度以神经微微塌陷为宜。假手术组大鼠暴露坐骨神经后不结扎，完成操作后分层缝合肌肉及皮肤，安尔碘消毒。大黄素组于造模后第1天每日灌胃1次，连续15 d，给药量为50 mg/kg，实验期间各组大鼠正常进食饮水。

1.3 行为学检测

参照文献，于术前及术后第3、7、11及15天用电子测痛仪及热辐射仪对不同组大鼠进行MWT及TWL值测定[11-13]。MWT及TWL值均重复测量5次，间隔5 min取平均值。

1.4 样品制备

术后15 d行为学测试结束后，将所有大鼠麻醉后取L4-L6损伤侧脊髓置于-80 ℃超低温冰箱中待检。

1.5 Western blot法检测

按照BCA试剂盒说明书对脊髓组织中提取的蛋白浓度进行测定，配制SDS-PAGE胶后开始加样。取30 ul样品缓慢加入样品孔中，用80 V进行浓缩胶电泳45 min，120 V在分离胶中电泳45 min，200 mA转膜120 min。膜浸在脱脂奶粉中室温封闭1 h；将膜取出直接放入一抗(1∶1000)中，4 ℃反应过夜；TBST洗膜，10 min×3次；将膜转入二抗(1∶40000)中，37 ℃反应1 h；PBST洗膜，10 min×3次；用化学发光法显影。ChemiDocTMMP全能型成像系统拍照。Gel Pro32软件分析不同条带灰度值进行统计分析处理。

1.6 RT-PCR检测

表1示，Trizol法提取总RNA，逆转录成cDNA，以cDNA为模板，选择RT-PCR反应的操作方法测定特异性mRNA的表达水平。使用SYBR©Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)进行PCR定量反应，采用PRIMER5软件/NCBI在线设计合成引物。各组样本的目的基因表达水平以相应GAPDH作为参照，最终采用2-ΔΔCT计算目的基因，相对于内参基因GAPDH的相对表达量。

表1 目的基因引物序列

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 行为学检测结果

造模后各组实验大鼠一般状况良好，可自由饮水、进食及活动，毛发整洁，术侧肢体未见感染及渗液，无自噬行为。结合现有文献及前期预实验结果，于术后第3天评判模型成功与否。本课题组前期进行大量探索，模型成功率达85%以上[10]。

2.1.1 MWT值测定 表2示，与术前基线值比较，术后第3天CCI模型组及大黄素组实验大鼠MWT值下降幅度为27.41%及23.57%，出现机械痛觉过敏，与既往文献报道基本相符[10]；与假手术组比较差异有统计学意义(P<0.01)。于术后第11天开始，大黄素组MWT值较前升高，与CCI模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)，说明大黄素能够缓解CCI大鼠机械痛觉过敏。

表2 MWT值测定结果

2.1.2 TWL值测定 表3示，与术前基线值比较，术后第3天模型组及大黄素组大鼠TWL值下降幅度为48.68%及41.03%，出现较为严重的热痛觉过敏；与假手术组比较差异有统计学意义(P<0.01)。于术后第11天开始，大黄素组TWL值较前升高，与CCI模型组比较差异有统计学意义，说明大黄素能缓解CCI大鼠热痛觉过敏。

表3 TWL值测定结果

2.2 RT-PCR技术检测脊髓组织中MBP、MPZ mRNA

图1示，与假手术组比较，模型组中MBP及MPZ表达水平显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，大黄素组实验大鼠脊髓组织中MBP及MPZ表达均升高(P<0.05)。

2.3 Western blot法脊髓组织MBP及MPZ蛋白表达

图2示，与假手术组比较，模型组中MBP及MPZ蛋白表达水平显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，大黄素组实验大鼠脊髓组织中MBP及MPZ表达均升高(P<0.05)。

注:与假手术组比较：*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较：#P<0.05，##P<0.01图1 脊髓组织MBP及MPZ mRNA转录水平比较

注:与假手术组比较:*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较:#P<0.05，##P<0.01图2 脊髓组织MBP及MPZ 蛋白表达水平比较

3 讨论

神经损伤是NP形成的重要原因。早期研究已证实，损伤后相关神经出现华勒氏变性并启动自我破坏程序，这一机制是神经病理性疼痛形成的重要组成部分[14]。而目前研究表明，神经系统中胶质细胞凋亡形成脱髓鞘改变，髓鞘蛋白崩解使轴索失去保护作用，进而通过干预兴奋性电位的形成产生痛感。这种信号传导障碍与中医理论中疼痛形成 “不通则痛”病因病机有一定的相似之处，与之相对应的是中药“活血祛瘀”治则。

大黄素是具有活血化瘀、通畅气机作用的中药大黄的主要成分之一。一些研究者发现，大黄素通过调节神经元凋亡及胶质细胞活性发挥抗炎作用。如在糖氧剥夺时大黄素可通过激活素A/Smads信号途径的活化下调Caspase-3表达来抑制神经元凋亡；而在脂多糖诱导的胶质细胞中，可激活AMPK/Nrf2通路，降低IL-6、TNF-α等炎症因子表达[15-16]。我们前期研究已发现，大黄素能够显著改善神经病理性疼痛CCI大鼠自发性疼痛及痛觉过敏表现，且50 mg/kg为优效剂量[8]。而本研究则进一步发现，大黄素能够显著上调CCI模型实验大鼠脊髓组织MBP及MPZ表达，促进髓鞘修复与再生，从而缓解疼痛。

髓鞘主要由神经胶质细胞构成，是包裹在神经轴索外的一层膜结构。中枢神经系统髓鞘由少突胶质细胞构成，周围神经系统则由施旺氏细胞构成，起到绝缘作用并有保护轴突作用，还能够提高神经冲动的传导速度。神经损伤后，由于内质网途径、氧化应激反应、谷氨酸兴奋毒性及炎症反应等多条不同信号途径激活后，会引起神经纤维退化并产生脱髓鞘改变，甚至神经元的凋亡[17-18]。

中枢神经系统含量最多的髓鞘蛋白MBP可由少突胶质细胞合成，能够维持髓鞘结构的稳定性和紧密性。实验研究已证实，在多种不同的NP模型脊髓组织中，MBP表达呈下调趋势[19-20]。本实验结果显示，模型组中MBP蛋白及其mRNA表达水平均较假手术组出现显著降低，而大黄素治疗组则出现升高，这一趋势的形成可能与神经损伤引起少突胶质细胞凋亡有关，而大黄素则可能通过抑制细胞凋亡提高MBP表达。MPZ也常被称为P0蛋白，主要由施旺氏细胞合成，因此被认为是施旺氏细胞的特殊标记蛋白，通过其本身的细胞黏附分子属性在维持髓鞘多层结构及紧密性中发挥关键作用[21]。P0蛋白在脱髓鞘作用激活后大量表达，并且当神经轴索出现华勒氏变性时出现降低，而在髓鞘再生的时候表达升高。尽管关于P0蛋白的中枢机制研究有限，但有多项研究结果证明，神经损伤后除外周神经、背根神经节中P0蛋白表达量出现下降外，NP大鼠脊髓中MPZ蛋白及其mRNA表达量也较对照组出现下降[22-24]。本次实验结果中，CCI模型后脊髓组织中MPZ较假手术组显著降低，而大黄素能够提高MPZ的表达水平，促进髓鞘再生，缓解神经病理性疼痛。

综上所述，本实验使用雄性SD大鼠建立NP中经典的CCI模型。前期研究结果及行为学测试提示，大黄素具有改善CCI大鼠痛觉过敏的作用，而结合本文的研究结果考虑其作用机制可能与升高髓鞘相关蛋白MBP和P0蛋白有关，并产生神经保护作用，从而改善大鼠对疼痛刺激过敏的反应。可见，大黄素可以作为具有研究潜力的防治NP药物。