艾灸足三里对化疗后骨髓抑制小鼠Notch信号通路的影响

叶 强，高 彤，梁花花，王亚军

(甘肃中医药大学针灸推拿系，兰州 730000)

目前在临床上化疗是手术、放疗等的辅助疗法，同时也是某些癌症患者的主要疗法。化疗对肿瘤的增殖、复发、转移具有显著的抑制效果，可明显改善临床结局。但是由于非靶向化疗药物缺乏对细胞识别的特异性，使其对正常体细胞具有明显的毒性，这其中尤以化疗药物的骨髓抑制作用导致的免疫抑制毒性最为突出。

中医在降低化疗药物毒性方面取得了较好效果。张志民等[1]发现，通过在化疗期间给予患者中医扶正培本法治疗，可以使急性白血病患者的胃肠道反应、骨髓抑制、肝功能损害、肾功能损害的发生率明显降低，周围血常规明显升高。另外还发现，正茂扶正颗粒[2]、黄芪注射液[3]、参麦注射液[4]、健脾益肾补血法[5]等多种中药单体或复方均可降低化疗药物对正常细胞的毒性，提高免疫力，缓解化疗副作用。大量基础研究[6-8]发现，艾灸对于化疗药物的骨髓抑制同样具有明显的改善作用。足三里是中医降低化疗药物细胞毒性，改善骨髓抑制最常用的穴位[9-10]，艾灸足三里已被证实在基础或临床均可有效降低化疗的毒副作用[11-12]，但其分子机制尚不清楚。本研究将在小鼠体内建造骨髓抑制模型，通过艾灸足三里观察其对骨髓抑制的治疗作用，并通过现代分子生物学的方法，初步探索其治疗机制，为临床应用提供理论基础。

1 材料

1.1 动物及分组

所有无特定病原体SPF级雄性C57BL/6 J小鼠，体质量16～22 g，6～8周龄，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号SCXK(京)2014-0008；Lewis肺癌荷瘤小鼠购自北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号SCXK(京)2014-0008。所有小鼠均在25 ℃、12 h/12 h的光照周期下自然饮食饮水饲养，并在实验前均适应性饲养1周。

1.2 试剂及仪器

环磷酰胺(CTX)(上海华联制药有限公司，060310)；艾条(李时珍医药集团有限公司)；4%多聚甲醛(北京Solarbio生物科技有限公司，P1110)；兔链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶(SP)免疫组化试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司，SP9001)；苏木素伊红染液试剂盒(北京Solarbio生物科技有限公司，G1120)；RIPA裂解液(上海碧云天生物技术有限公司，P0013B)；兔抗CBF-1/Suppressor of hairless/Lag(CSL)；多克隆抗体(英国Abcam公司，ab229866)；兔抗Jagged1多克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司，bs-1448R)；兔抗Jagged2多克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司，bs-4244R)；兔抗Notch1多克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司，bs-1335R)；兔抗Notch2多克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司，bs-21663R)；兔抗Nocth3多克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司，bs-1812R)；Trizol(大连Takara生物技术有限公司，9109)；逆转录试剂盒(大连Takara生物技术有限公司，RR047 A)；实时荧光定量PCR(rtPCR)试剂盒(大连Takara生物技术有限公司，RR820 A)；Leica切片机(德国Leica公司，RM2235)；电泳仪(美国Bio-Rad公司，PROTEAN)；PCR扩增仪(美国Bio-Rad公司，T100)；实时荧光定量PCR仪(美国Appliedbiosystems公司，StepOnePlus)。

2 方法

2.1 动物模型分组及其建立

32只雄性SPF级无特定病原体C57BL/6J小鼠适应性喂养1周后，按照随机数字表法分为正常组、空白组、模型组和治疗组每组8只。骨髓抑制模型的建立[13]：无菌条件下剥离Lewis肺癌鼠瘤块制成匀浆，调整至细胞浓度1 ×107/L，取0.2 ml 接种于每只C57BL/6 J小鼠腋下。接种第7 天选择肿瘤大小相似的荷瘤鼠，腹腔注射 CTX 100 mg·kg-1·d-1，连续3 d，制成骨髓抑制模型。

2.2 取穴方法

根据华兴邦等[14]研究，小鼠“足三里”位于腓骨小头下约 5 mm 处，后肢膝关节后外侧。

2.3 分组与治疗

荷瘤鼠随机分为空白组、模型组、治疗组，另设模拟接种的正常组，每组各8只。其中正常组在相同位置接种相同体积但无肿瘤细胞的磷酸盐缓冲液(PBS)，模型组腹腔注射CTX制成骨髓抑制模型，灌服生理盐水0.4 ml/d，连续5 d；治疗组腹腔注射 CTX 造模，灌服生理盐水0.4 ml/d，同时将艾条点燃后，高度固定在距离穴位皮肤 2 cm 处，时间为3 min，每日治疗1次，连续治疗5 d；空白组与正常组每天陪同抓取、固定不治疗。

2.4 一般状况观察

在整个实验过程中，每天记录各组小鼠体质量、饮食、大小便、活动、精神状况及外观变化等。

2.5 血常规检测

各组小鼠在造模前后与治疗期间共8 d时间内每天早上 7∶30经尾静脉取血10 μL，置于事先加好 390 μL 3%冰乙酸稀释液的试管中，用以检测外周白细胞计数。

2.6 取材

治疗5 d后，各组8只小鼠脱颈处死，在放置干冰的超净工作台上取两侧股骨，剔净骨头后用生理盐水冲洗，在75%乙醇中浸泡2 min后再用生理盐水冲洗，一侧股骨立即放入4%多聚甲醛中固定并脱钙；另一侧股骨再用无RNase的生理盐水冲洗后，在无RNase的环境下用无RNase的PBS冲出其中的骨髓细胞，将所得细胞分成2份，分别于2000rpm离心5 min后，立即提取RNA和蛋白质。

2.7 HE病理检测

将充分固定和脱钙的股骨做石蜡切片后，石蜡切片经过二甲苯脱蜡、梯度酒精水化后放入苏木素染色，随后0.5%盐酸乙醇分化，自来水冲洗返蓝。再用95%乙醇浸泡后伊红染色30 s，经梯度酒精和二甲苯脱水，中性树胶封片、拍照。

2.8 免疫组化检测骨髓组织中CSL、Jagged1、Jagged2蛋白的变化

将充分固定和脱钙的股骨做石蜡切片后，按照1.2.5下过程对石蜡切片进行脱蜡水化，然后将水化的切片放入10mM的pH6.0枸橼酸钠溶液中进行微波-酸修复，PBS洗涤3次，滴加3%过氧化氢消除内源性过氧化物酶，PBS洗涤，山羊血清37 ℃封闭10 min倾去勿洗，滴加一抗(稀释比例)4 ℃孵育过夜，PBS洗涤，滴加生物素标记的二抗37 ℃孵育30 min，PBS洗涤，滴加辣根过氧化物酶(HRP)标记的链霉素37 ℃孵育30 min，PBS洗涤，滴加二氨基联苯胺(DAB)反应液显色适宜，自来水冲洗，苏木素复染，盐酸酒精分化，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜拍照，采用ImageProPlus软件对阳性颗粒进行测量。

2.9 Western bloting实验检测骨髓组织中Notch1、Notch2、Notch3信号通路相关蛋白

骨髓细胞计数离心后，每1×106-7个细胞加入含有1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA裂解液500 μL，在冰上裂解30 min，13000rpm离心15 min，取上清10 μL进行蛋白定量。另外上清加入5×上样缓冲液，100 ℃水浴5 min，依次经过SDS-PAGE凝胶电泳、转膜、5%脱脂牛奶封闭，4 ℃孵育一抗过夜，室温孵育二抗2 h后，增强化学发光法(ECL)显色，自动曝光仪进行曝光、拍照，半定量分析条带。

2.10 RT-PCR实验检测骨髓组织中Notch1、Notch2、Notch3信号通路相关mRNA

在无RNase条件下骨髓细胞计数离心后，每1×106-7个细胞加入Trizol 500 μL，充分裂解细胞后，12000rpm离心5 min取上清，加入氯仿混匀后室温静置5 min，12000rpm离心5 min，取上层水相，加入等体积的异丙醇，室温静置5 min；12000rpm离心10 min，管底可见微量RNA沉淀；弃去上清，加入75%乙醇1 mL，悬浮沉淀；12000rpm离心10 min，弃上清，室温干燥10 min；用20 μL 焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解RNA；然后依次经过逆转录反应、实时荧光定量PCR，对RNA进行定量分析。

实时荧光定量PCR的程序如下：Step1：95 ℃ 30 s；Step2：95 ℃ 5s，60 ℃ 30 s；step3：GOTO step2，共计45 个循环数。

表1 引物序列

2.11 统计学方法

3 结果

3.1 行为学观察

正常组与空白组从造模到治疗结束，小鼠体质量增加 1～3 g 不等，精神佳，毛发稠密，毛色光泽，饮食饮水正常，大小便正常，动作灵活，对外界刺激反应灵敏；模型组小鼠从造模到治疗结束，小鼠体质量下降 1～3 g 不等，精神差，毛发稀疏，毛色暗淡无光，大便溏，个别小鼠有血便，进食饮水量减少，行动迟缓，多鼠扎堆，对外界刺激反应降低；艾灸组小鼠造模后出现体质量下降 1～3 g不等，精神差，毛色暗淡无光，进食饮水量减少，行动迟缓等情况；治疗5 d后体质量基本维持在原基数水平，皮毛尚有光泽，进食饮水量正常，大便正常，无扎堆情况，活动基本正常，对外界刺激反应尚可，较模型组有所改善。

3.2 各组小鼠血液中白细胞数目变化

表2示，正常组及空白组在造模前后的整个过程中，外周血白细胞数目未发生显著性变化；模型组和艾灸组小鼠在造模前白细胞数目正常，第1次造模后第2天起二者外周血白细胞数目显著减少(P<0.05)，并随造模时间的增加和造模次数的增多，白细胞数目逐渐显著下降(P<0.05)。

表2示，正常组、空白组及模型组在治疗前后的整个过程中，外周血白细胞数目未发生显著性变化，其中正常组、空白组小鼠保持在正常范围内，模型组小鼠保持在低水平范围内；艾灸组小鼠在治疗前白细胞数目很少，随治疗时间的增加白细胞数目逐渐显著升高，至第5天时已达到正常水平(P<0.05)。

表2 CTX造模前后及治疗前后各组小鼠外周血白细胞计数变化比较

3.3 各组小鼠骨髓病理变化

正常组和空白组骨髓组织结构保持完整，骨髓细胞均一分布；模型组小鼠骨髓组织的结构遭到破坏，骨髓细胞分布紊乱，细胞密度减少；治疗组小鼠骨髓组织结构恢复正常，骨髓细胞密度上升，结构完整(见图1)。

图1 各组小鼠骨髓病理变化比较(×200)

3.4 各组小鼠骨髓组织中CSL、Jagged1、Jagged2蛋白的变化

图2示，正常组和空白组小鼠骨髓组织中CSL、Jagged1、Jagged2蛋白变化无差异。与空白组小鼠比较，模型组小鼠骨髓组织中CSL、Jagged1、Jagged2蛋白表达均显著降低(P<0.05)；与模型组小鼠比较，艾灸组小鼠骨髓组织中CSL、Jagged1、Jagged2蛋白表达均显著升高(P<0.05)。

注：A.CSL、Jagged1、Jagged2的免疫组化图；B.各蛋白表达量的半定量统计数据;与空白组比较：**P<0.01；与模型组比较： ##P<0.01图2 各组小鼠骨髓组织中CSL、Jagged1、Jagged2蛋白变化比较(×200)

3.5 各组小鼠骨髓组织中Notch1、Notch2、Notch3蛋白的变化

正常组和空白组小鼠骨髓组织中Notch1、Notch2、Notch3蛋白变化无差异。与空白组小鼠比较，模型组小鼠骨髓组织中Notch1、Notch2、Notch3蛋白表达均显著降低(P<0.05)；图3示，与模型组小鼠比较，艾灸组小鼠骨髓组织中Notch1、Notch2、Notch3蛋白表达均显著升高(P<0.05)。

注：A.Western bloting蛋白条带；B.蛋白条带的统计分析，与空白组比较：**P<0.01；与模型组比较：#P<0.05，##P<0.01图3 各组小鼠骨髓组织中Notch1、Notch2、Notch3蛋白变化比较

3.6 各组小鼠骨髓组织中Notch1、Notch2、Notch3 mRNA的变化

图4示，正常组和空白组小鼠骨髓组织中Notch1、Notch2、Notch3 mRNA变化无差异。与空白组小鼠比较，模型组小鼠骨髓组织中Notch1、Notch2、Notch3 mRNA表达均显著降低(P<0.05)；与模型组小鼠比较，艾灸组小鼠骨髓组织中Notch1、Notch2、Notch3 mRNA表达均显著升高(P<0.05)。

注：与空白组比较：*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较：#P<0.05，##P<0.01图4 各组小鼠骨髓组织中Notch1、Notch2、Notch3 mRNA变化比较

4 讨论

根据2018年全球肿瘤年报[15]，2018年全球新增1800万癌症病例及960万癌症死亡病例中，中国新增病例数占380.4万例，死亡病例数占229.6万例，发病率、死亡率均为全球第一。在治疗方面，手术、放疗和化疗等传统肿瘤疗法是我国临床及患者的首要选择。大部分化疗药物是基于肿瘤细胞与正常体细胞之间的增殖差异研发的，通过抑制细胞的DNA合成，阻止肿瘤快速增殖，诱导肿瘤细胞凋亡。成年人的大部分体细胞均处于非增殖状态或缓慢增殖状态，化疗药物对其具有较低的抑制毒性，但是骨髓细胞及其免疫系统细胞需要时刻保持高速的增殖速度，以面对内外环境引起的免疫反应，保护机体。因此在化疗过程中，化疗药物对骨髓细胞增殖抑制造成的患者免疫抑制，使患者极易发生感染、出血，影响其癌症治疗和生活质量，增加额外的治疗成本，甚至威胁生命，因此降低化疗药物的骨髓抑制毒性对患者具有重大意义。本研究发现，在小鼠体上采用艾灸足三里穴位的疗法，可有效升高由于化疗药物CTX所导致的减少血液白细胞数目，逆转改善化疗药物所造成的骨髓组织破坏，解除CTX对骨髓的抑制作用。与前人研究结果一致。

但是艾灸足三里改善化疗药物的骨髓抑制分子机制目前尚不清楚，相关研究比较少。研究发现，Notch信号通路与骨髓的造血功能密切相关，在造血细胞发育的不同阶段，Notch 通路可影响其生存、增殖及分化，包括造血干细胞的自我更新及分化[16]；在T 祖细胞进入胸腺发育的过程中，均有 Notch 信号通路的参与[17]，且 Notch 信号通路可促进 T细胞的发育，抑制B细胞发育[18]；现在更多的研究发现，肿瘤性疾病与Notch 信号通路的活化密切关系[19]，因此本研究将基于Nocth信号通路，研究艾灸足三里改善化疗药物骨髓抑制的分子机制。

Notch信号通路由Notch受体(Notch1、Notch2、Notch3、Notch4)、Notch配体(Delta-like 1,3,4，Jagged1和Jagged2)、CSL DNA结合蛋白及其他效应物和Notch的调节分子等组成。Notch信号的产生是通过相邻细胞的Notch配体与受体相互作用实现的。Notch蛋白经过3次剪切，由胞内段(NICD)释放入胞质，并进入细胞核与转录因子CSL结合,形成NICD/CSL转录激活复合体，从而激活HES、HEY、HERP等碱性-螺旋-环-螺旋(basichelix-loop- helix,bHLH)转录抑制因子家族的靶基因，发挥生物学作用。本研究发现，经化疗药物CTX干预后，在蛋白水平上小鼠骨髓组织中CSL、Jagged1、Jagged2、Notch1、Notch2、Notch3蛋白表达均受到抑制，同时在mRNA水平Notch1、Notch2、Notch3的表达同样显著下降。但是经过艾灸足三里治疗后，骨髓抑制模型小鼠骨髓组织中表达或激活被抑制的CSL、Jagged1、Jagged2、Notch1、Notch2、Notch3蛋白均解除了抑制，表达水平均显著升高，在mRNA水平Notch1、Notch2、Notch3的表达同样显著上升。以上提示，艾灸足三里可激活骨髓抑制模型中被抑制的Notch信号通路，这可能与其减轻化疗药物骨髓抑制密切相关，但具体分子机制还需进一步研究。

综上可知，CTX可降低骨髓组织中Notch信号通路的激活程度，产生骨髓抑制。艾灸足三里可导致骨髓抑制模型的骨髓组织中Notch信号通路相关蛋白的表达升高，激活Notch信号通路，治疗或缓解化疗药物导致的骨髓抑制，但其具体分子机制仍需进一步研究。