吡柔比星调控原钙黏蛋白10的表达对多发性骨髓瘤细胞增殖、凋亡诱导的作用机制研究

朱平，梁欣泉，廖欣，熊慕珺，符丽梅

多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是常见的血液系统恶性肿瘤，目前主要治疗方法为化疗和干细胞移植，虽然新药的出现使其疗效和生存得到了较大的改善，但仍不可治愈，多以减少疾病复发、延缓疾病进展、延长生存期作为治疗目标[1]。吡柔比星(pirarubicin，THP)是一种抗癌的化疗药物，有研究证明吡柔比星可有效诱导膀胱癌细胞凋亡，且增加药物的浓度抑制效果更好，还能有效预防术后复发[2]；吡柔比星治疗晚期乳腺癌效果更优，能明显延长生存期，且未出现严重的不良反应[3]；吡柔比星对治疗多发性骨髓瘤也有较好的的疗效，其对多发性骨髓瘤患者的心脏毒性、脱发和肝肾功能损伤等不良反应明显减少[4]。但吡柔比星对多发性骨髓瘤细胞增殖、凋亡的作用机制尚未清楚。原钙黏蛋白10(protocadherin 10，PCDH10)是一种抑癌基因，PCDH10基因可能通过下调PI3K/AKT通路活性而抑制多发性骨髓瘤细胞RPMI-8226的增殖、迁移和侵袭[5]。本研究旨在研究吡柔比星是否通过PCDH10影响多发性骨髓瘤细胞增殖、凋亡，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 多发性骨髓瘤细胞KM3购自中国科学院上海细胞库；胎牛血清、RPMI-1640培养基、胰蛋白酶购自美国Gibico公司；Trizol试剂、反转录试剂盒、荧光定量试剂盒购自日本TaKaRa公司；MTT试剂盒、膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)和碘化丙锭(PI)试剂盒、BCA试剂盒、RIPA蛋白裂解液、SDS-PAGE试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；Lipofectamine TM 2000转染试剂购自美国Invitrogen公司；抗体购自上海煊翎生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：多发性骨髓瘤细胞KM3用含10 %胎牛血清的RPMI-1640培养基于37 ℃、5%CO2饱和湿度条件下培养，每天换液1次，待细胞融和至70 %左右时，加入胰蛋白酶进行消化传代，选取对数生长期的细胞进行实验。

1.2.2 分组与药物处理：取对数生长期细胞，将其接种至96孔板中，并用不同浓度的吡柔比星(0.1 mg/L、1 mg/L、2.5 mg/L、5 mg/L)处理KM3细胞，记为THP 0.1mg/L组、THP 1 mg/L组、THP 2.5mg/L组、THP 5mg/L组；未经任何处理的KM3细胞作空白对照(Con)组。

取常规培养的多发性骨髓瘤细胞KM3用0.25 %胰蛋白酶消化后接种于96孔板中，待细胞生长至80%融合，更换为无血清培养基同步化12 h，随后进行转染。转染分为pcDNA3.1组(转染pcDNA3.1)、pcDNA3.1-PCDH10组(转染pcDNA3.1-PCDH10)、si-NC组(转染si-NC)、si-PCDH10组(转染si-PCDH10)；si-NC组和si-PCDH10组转染后再用1 mg/L吡柔比星处理48 h，记作THP 1 mg/L+si-NC组、THP 1 mg/L+si-PCDH10组。

1.2.3 MTT法检测细胞增殖：在以上各组细胞培养至24 h、48 h、72 h时加入20 μl(5 g/L)MTT溶液，继续孵育4 h；弃去多余培养基并加入150 μl DMSO振荡反应10 min，酶标仪检测490 nm处吸光度(OD)值。细胞活性(%)=实验组OD值/空白对照组OD值×100%。每组重复3次。

1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡:用不含EDTA的胰酶消化各组细胞，离心收集各组细胞，PBS漂洗2次，加结合缓冲液重悬细胞。依据试剂盒说明书，先后加入Annexin V-FITC和PI避光孵育。流式细胞仪检测激发波长488 nm和发射波长530 nm处的荧光强度。实验重复3次。

1.2.5 Western-blot法检测PCDH10蛋白表达:收集各组细胞，加入RIPA裂解液裂解，4 ℃，12 000 g离心15 min，收集蛋白上清液，BCA试剂盒测定蛋白浓度。将蛋白样品进行SDS-PAGE电泳后转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭液室温封闭1 h。分别加入一抗(1∶1 000)，4℃孵育过夜，TBST洗膜；加入二抗(1∶2 000)室温孵育2 h，TBST洗涤3次，每次10 min，后在暗室中曝光显影，再浸入定影，最后洗去残液晾干，将胶片用Quantity One凝胶分析软件处理，测定各组蛋白条带的吸光度，以目的条带和GAPDH条带的比值作为蛋白表达水平。每个蛋白样品重复3次。

2 结 果

2.1 不同浓度的THP对多发性骨髓瘤细胞KM3增殖的影响 MTT法检测结果(图1A)显示，与Con组相比，不同浓度THP组多发性骨髓瘤细胞KM3的活性显著降低，呈浓度依赖性(P<0.05); Western-blot法检测结果(图1B)显示，与Con组相比，不同浓度THP组多发性骨髓瘤细胞KM3中Cyclin D1蛋白的表达水平显著降低，p21蛋白的表达水平显著升高(P<0.05)。选择对多发性骨髓瘤细胞KM3抑制率约为50%的THP浓度(1 mg/L)做后续实验。

2.2 THP对多发性骨髓瘤细胞KM3凋亡的影响 流式细胞仪检测结果(图2A)显示，与Con组相比，THP 1 mg/L组多发性骨髓瘤细胞KM3的凋亡率显著升高(P<0.05)。Western-blot法检测结果(图2B)显示，与Con组相比，THP 1 mg/L组多发性骨髓瘤细胞KM3中Bax蛋白的表达水平显著升高，Bcl-2蛋白的表达水平显著降低(P<0.05)。

2.3 THP对多发性骨髓瘤细胞KM3中PCDH10蛋白表达的影响 Western-blot法检测结果(图3A、B)显示，与Con组相比，THP 1 mg/L组多发性骨髓瘤细胞KM3中PCDH10蛋白的表达水平显著升高(P<0.05)。

2.4 过表达PCDH10对多发性骨髓瘤细胞KM3增殖、凋亡的影响 流式细胞仪检测结果(图4A)显示，与pcDNA3.1组相比，pcDNA3.1-PCDH10组多发性骨髓瘤细胞KM3的凋亡率显著升高(P<0.05)。MTT法检测结果(图4B)显示，与pcDNA3.1组相比，pcDNA3.1-PCDH10组多发性骨髓瘤细胞KM3的活性显

著降低(P<0.05)。Western-blot法检测结果(图4C)显示，与pcDNA3.1组相比，pcDNA3.1-PCDH10组多发性骨髓瘤细胞KM3中Cyclin D1、Bcl-2蛋白的表达水平显著降低，PCDH10、p21、Bax蛋白的表达水平显著升高(P<0.05)。

2.5 抑制PCDH10表达对THP抑制多发性骨髓瘤细胞KM3增殖的影响 MTT检测结果(图5A)显示，与Con组相比，THP 1 mg/L组多发性骨髓瘤细胞KM3的活性显著降低；与THP 1 mg/L+si-NC组相比，THP 1 mg/L+si-PCDH10组多发性骨髓瘤细胞KM3的活性显著升高(P<0.05)。Western-blot法检测结果(图5B)显示，与Con组相比，THP 1 mg/L组多发性骨髓瘤细胞KM3中Cyclin D1蛋白的表达水平显著降低，PCDH10、p21蛋白的表达水平显著升高(P<0.05)；与THP 1 mg/L+si-NC组相比，THP 1mg/L+si-PCDH10组多发性骨髓瘤细胞KM3中Cyclin D1蛋白的表达水平显著升高，PCDH10、p21蛋白的表达水平显著降低(P<0.05)。

2.6 抑制PCDH10表达对THP促进多发性骨髓瘤细胞KM3凋亡的影响 流式细胞仪检测结果(图6A)显示，与Con组相比，THP 1 mg/L组多发性骨髓瘤细胞KM3的凋亡率显著升高；与THP 1 mg/L+si-NC组相比，THP 1 mg/L+si-PCDH10组多发性骨髓瘤细胞KM3的凋亡率显著降低(P<0.05)。Western-blot法检测结果(图6B)显示，与Con组相比，THP 1 mg/L组多发性骨髓瘤细胞KM3中Bcl-2蛋白的表达水平显著降低，Bax蛋白的表达水平显著升高；与THP 1 mg/L+si-NC组相比，THP 1 mg/L+si-PCDH10组多发性骨髓瘤细胞KM3中Bcl-2蛋白的表达水平显著升高，Bax蛋白的表达水平显著降低(P<0.05)。

注：A.不同浓度THP对多发性骨髓瘤细胞KM3增殖的影响；B.不同浓度THP对多发性骨髓瘤细胞KM3增殖蛋白表达的影响。与Con组比较，aP<0.05；与THP 0.1 mg/L组比较，bP<0.05；与THP 1 mg/L组比较，cP<0.05；与THP 2.5 mg/L组比较，dP<0.05

图1不同浓度THP对多发性骨髓瘤细胞KM3增殖的影响

注：A.THP对多发性骨髓瘤细胞KM3凋亡的影响;B.THP对多发性骨髓瘤细胞KM3凋亡蛋白表达的影响；与Con组比较，aP<0.05

图2THP对多发性骨髓瘤细胞KM3凋亡的影响

注：A.THP对多发性骨髓瘤细胞KM3中PCDH10蛋白表达的影响; B.PCDH10蛋白的相对表达；与Con组比较，aP<0.05

图3THP对多发性骨髓瘤细胞KM3中PCDH10表达的影响

3 讨 论

多发性骨髓瘤会引起组织、器官损伤，严重影响患者的生存质量，近几年随着新的治疗药物的出现，生存率明显提高[6]。吡柔比星是蒽环类抗肿瘤抗生素，灌注治疗后能有效抑制膀胱癌复发[7]；吡柔比星动脉灌注化疗可显著提高非转移性四肢骨肉瘤的近期临床疗效，提高患者生存率，并提高T淋巴细胞亚群水平[8]。吡柔比星还能诱导人膀胱癌T24细胞凋亡[9]；通过下调XIAP可抑制鼻咽癌细胞的增殖，诱导细胞凋亡[10]。而含吡柔比星的方案治疗多发性骨髓瘤患者，可以显著减少并发症，保证治疗效果[11]。硼替佐米和地塞米松(BD)方案联合环磷酰胺、吡柔比星化疗组能明显提高复发或难治性多发性骨髓瘤患者的缓解率，并可延缓病情进展及延长生存时间，患者耐受性好[12]。本实验研究结果也表明，不同浓度的吡柔比星可抑制多发性骨髓瘤细胞的增殖，促进细胞凋亡；抑制CyclinD1、Bcl-2蛋白的表达，促进PCDH10、p21、Bax蛋白的表达。

注：A.过表达PCDH10对多发性骨髓瘤细胞KM3凋亡的影响;B.过表达PCDH10对多发性骨髓瘤细胞KM3增殖的影响;C.过表达PCDH10对多发性骨髓瘤细胞KM3增殖、凋亡蛋白表达的影响；与pcDNA3.1组比较，aP<0.05

图4过表达PCDH10对多发性骨髓瘤细胞KM3增殖、凋亡的影响

注：A.抑制PCDH10表达对THP抑制多发性骨髓瘤细胞KM3增殖的影响;B.抑制PCDH10表达对THP抑制多发性骨髓瘤细胞KM3增殖蛋白表达的影响；与Con组比较，aP<0.05；与THP 1 mg/L+si-NC组比较，bP<0.05

图5抑制PCDH10表达对THP抑制多发性骨髓瘤细胞KM3增殖的影响

注：A.抑制PCDH10表达对THP促进多发性骨髓瘤细胞KM3凋亡的影响;B.抑制PCDH10表达对THP促进多发性骨髓瘤细胞KM3凋亡蛋白表达的影响；与Con组比较，aP<0.05；与THP 1 mg/L+si-NC组比较，bP<0.05

图6抑制PCDH10表达对THP促进多发性骨髓瘤细胞KM3凋亡的影响

PCDH10是钙黏蛋白超家族中的跨膜蛋白，恶性肿瘤中原钙黏蛋白的表达下调或者缺失与癌症进展有关[13]。研究发现，PCDH10在结直肠癌组织中异常甲基化，癌旁组织中表达高于癌组织，PCDH10的甲基化和表达沉默参与结直肠癌的进展[14]。PCDH10在胃癌组织和舌鳞状细胞癌中也表达下调，与肿瘤发生进展及患者预后相关[15-16]。PCDH10上调通过抑制肝癌细胞中PI3K/Akt信号通路从而抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡[17]。过表达PCDH10能够明显抑制胰腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力，并且诱导胰腺癌BXPC-3细胞凋亡[18]。研究发现，PCDH10基因通过PI3K/Akt通路可抑制多发性骨髓瘤细胞增殖、迁移、侵袭及血管新生能力；PCDH10不仅可增强多发性骨髓瘤细胞对表阿霉素的敏感性，还可减少多发性骨髓瘤细胞逃避表阿霉素的杀伤，从而增强表阿霉素的抗骨髓瘤效应[19-20]。本实验研究结果也发现，过表达PCDH10可抑制多发性骨髓瘤细胞的增殖，促进细胞凋亡；且抑制PCDH10表达能逆转THP对多发性骨髓瘤细胞KM3增殖抑制和凋亡促进作用。

综上所述，吡柔比星可抑制多发性骨髓瘤细胞的增殖，促进其凋亡，其机制可能与上调PCDH10有关，本研究将为多发性骨髓瘤的治疗提供新思路和新靶点。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

朱平：设计研究方案，实施研究过程，统计学分析，撰写、修改论文；梁欣泉：提出研究思路，论文审核；廖欣：分析实验数据；熊慕珺：资料收集；符丽梅：实施实验，论文修改