基于辐射防护基因集预测的辐射损伤防护化合物活性评价

贾广彦，刘祯，钱坤，周喆

1.军事医学研究院 辐射医学研究所，北京 100850；2.解放军960医院，山东 济南 250031

辐射防护剂是防护与救治核辐射损伤最为有效和直接的手段之一[1]。随着电离辐射应用领域的增加，辐射防护药物需求也愈显迫切。多年来，各国学者对人工合成化合物、天然化合物和生物因子在内的大量候选药物进行了研究和筛选[2]，这些方法费时费力，在寻找高效低毒的辐射防护剂方面进展比较缓慢[3]。

老药重利用（也称药物重定位）是基于已有的药物发现其新用途，因对其毒副作用了解较为清楚，因此开发成功的概率更高，是新药研发的有效手段之一[4]。计算预测分析和实验筛选过程是老药新用研究的两大方法[5]。本单位多年来从事多组学数据的计算分析，以探寻已上市药物新的适用范围，为新药研发提供新的思路方法。任磊[6-7]等利用转录组数据结合辐射损伤特征筛选辐射损伤防护候选药物，并进行实验验证证明了巴氯芬、阿米洛利等药物具有辐射损伤防护作用，为使用药物重定位策略寻找有效的辐射损伤防护药物提供了有力参考。为从上市药物中发现辐射损伤防护剂，刘祯[8]等利用基于网络的细胞反应印记整合文库（LINCS）计划[9]的小分子化合物刺激不同细胞系的转录谱数据，构建算法评估化合物的辐射损伤防护作用，预测出了299种可能具有辐射损伤防护作用的药物。本研究对基于辐射防护基因集预测的系列化合物中排名靠前的结构进行了药效学评价，发现了具有辐射损伤防护作用的药物来那度胺，并进一步探讨了其辐射损伤防护作用涉及的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

SPF级雄性 C57BL/6J小鼠，6～8周龄，体重18～22 g，购于北京斯贝福生物技术有限公司，合格证号［SCXK（京）-2019-0010］。

来那度胺（lenalidomide）、醛脱氢酶-2激动剂（ALDA-1）、氨磷汀（WR2721）购自 MedChemExpress公司；全自动血细胞分析仪为北京宝灵曼阳光科技有限公司产品；倒置荧光显微镜为Nikon公司产品。

1.2 30 d存活率实验

我们在刘祯[8]等预测的299种抗辐射药物中选择了来那度胺和ALDA-1于动物模型上验证其是否具有辐射损伤防护作用。C57BL/6J小鼠饲养于军事医学研究院SPF级动物房，相对湿度为50%±10%，12 h灯光12 h黑暗，喂常规饲料，自由饮水。实验前3 d观察有无异常。小鼠按体重随机分为辐射对照（等容生理盐水）组、WR2721（150 mg/kg）组（阳性对照）、来那度胺（200 mg/kg）组、ALDA-1（5 mg/kg）组，每组10只。2种药物溶媒为分析纯DMSO。每日腹腔注射给药1次，给药5 d。WR2721组照射前30 min腹腔注射给药。末次给药后用60Co γ射线（军事医学研究院钴源）对各组小鼠进行一次性全身照射，照射剂量8 Gy，照射剂量率为69.27 cGy/min。照射后30 d观察各组小鼠生存情况。

1.3 外周血白细胞、血小板、淋巴细胞测定

由于来那度胺辐射损伤防护效果较好，后续实验对其作用机制进行了研究。C57BL/6J小鼠按体重随机分为辐射对照（等容生理盐水）组、WR2721（150 mg/kg）组（阳性对照）、来那度胺（200 mg/kg）组，每组10只，每日腹腔注射给药1次，给药5 d。WR2721组照射前30 min腹腔注射给药。末次给药后用60Co γ射线对各组小鼠进行一次性全身照射，照射剂量6.5 Gy，剂量率为68.33 cGy/min。另取10只同龄C57BL/6J小鼠作为正常组。

照射后第4、7、11、18、21 d照射各组与正常组小鼠尾静脉取血20 μL，加入3%柠檬酸钠2 μL抗凝后用全自动血细胞分析仪检测白细胞、血小板和淋巴细胞数量。

1.4 骨髓病理分析

上述6.5 Gy60Co γ射线照射各组与正常组小鼠各2只于照后第14 d取股骨，剔除股骨附着的软组织，置于4%多聚甲醛固定液中，16 h后常规脱水，浸蜡，石蜡包埋，切片，HE染色后在200倍显微镜下观察骨髓造血组织情况并摄像。

1.5 数据统计

采用SPSS19.0软件进行分析，白细胞、血小板、淋巴细胞数量以x±s表示，采用方差分析（One-Way ANOVA）或秩和检验。动物存活率采用生存分析Log Rank检验。

2 结果

2.1 来那度胺对辐射小鼠30 d生存率的影响

经8 Gy60Co γ射线照射后30 d，辐射对照组小鼠存活率为50%，ALDA-1和来那度胺组小鼠存活率为100%（图1），说明预测结构来那度胺、ALDA-1在动物模型上具有较好的辐射损伤防护作用。后续实验中我们针对来那度胺的辐射损伤防护机制进行研究。

图1 来那度胺对致死剂量辐射损伤小鼠的保护作用

2.2 来那度胺对辐射损伤小鼠白细胞、血小板、淋巴细胞数量的影响

经6.5 Gy60Co γ射线照射后，各组小鼠的血液生化指标均显著降低并且随时间有不同程度的回升。与辐射对照组相比，来那度胺组和阳性对照组小鼠白细胞数量回升更早，照射后第11 d辐射对照组小鼠白细胞数量还在降低，而来那度胺组和阳性对照组已显示出白细胞的恢复，照射后第21 d各组小鼠白细胞数量恢复至相近水平，以来那度胺组略优，差异有统计学意义（P＜0.05）（表1）。来那度胺组和阳性对照组照射后淋巴细胞回升趋势好于辐射对照组，相比差异显著（P＜0.05）（表2）。在血小板回升过程中，来那度胺组和阳性对照组不仅回升趋势好于辐射对照组，并且第21 d恢复程度也明显优于辐射对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）（表3）。可见来那度胺可减少白细胞、血小板、淋巴细胞数量下降的程度，并有助于其恢复。

表1 来那度胺对辐射小鼠白细胞数量的影响

表2 来那度胺对辐射小鼠淋巴细胞百分比的影响

表3 来那度胺对辐射小鼠血小板数量的影响

2.3 来那度胺对辐射小鼠骨髓脂肪化和细胞增生的影响

HE染色切片（图2）显示，正常组小鼠股骨骨髓未见脂肪滴，细胞分裂活跃，细胞增生明显，骨髓细胞排列紧密；辐射对照组小鼠骨髓重度脂肪滴化，内有重度出血，骨髓造血细胞缺乏，细胞增生不明显，重度骨髓细胞耗竭；来那度胺组小鼠股骨骨髓轻度脂肪滴化，骨髓轻度出血，骨髓细胞增生，轻度骨髓细胞耗竭；WR2721组小鼠骨髓轻度脂肪滴化，骨髓内有轻度出血，骨髓细胞显著增生。病理学观察结果显示来那度胺可减轻全身照射诱导的小鼠骨髓脂肪化，减少骨髓出血，促进骨髓增生，表明其辐射防护机制可能涉及保护小鼠造血系统，减轻造血组织的损伤。

图2 来那度胺对辐射损伤小鼠骨髓组织形态的影响（HE×200）

3 讨论

辐射损伤防护药物在国防、反恐、和平利用原子能等方面都有很大价值[10]，经过近半世纪的努力，抗辐射损伤药物研究已取得一些进展，有些药物已应用于临床，包括氨硫基类化合物、细胞因子类、激素类、天然药物等[11]。现有的辐射损伤防护作用药物仍存在许多的问题，如多数防护药物作用单一，无法满足对中重度急性辐射损伤患者治疗的需求[12]，有些药物毒性低但防护效价低、有效时间短[13]，有些药物防护效价较高但不良反应大[14]，因此寻找高效低毒的新型抗辐射药物仍然具有重要意义。

药物重定位是发掘已知药物的新用途，探寻其新的适用范围，由于基于已上市药物，该策略可降低开发风险，研发效率高[15]。十几年来，各类组学技术的蓬勃发展和广泛应用[16]，积累了多组学、多层次的海量数据，使生物医学进入大数据时代，大数据分析为发现新的药物作用模式[17]、药物作用机理辨识、药物重定位[18]等提供了新的技术方法。基于辐射防护基因集预测抗辐射药物，是一种基于化合物或药物基因表达谱发现已上市药物新用途的方法。此模式基于临床已经使用的药物，其药物作用特点研究比较充分。本研究对基于辐射防护基因集预测的抗辐射药物的防护作用进行了验证，筛选出具有抗辐射活性的结构来那度胺。来那度胺是第二代免疫调节剂，具有抗血管生成、改善免疫功能、肿瘤杀伤和改变骨髓微环境等多种作用机制，已上市多年，临床上用于好几种血液病的治疗[19]。本研究发现其在动物模型上具有辐射损伤防护作用，提示其进一步研发为辐射防护剂的可能性。本研究也以实验药理学依据证明转录组数据在抗辐射药物重定位研究中的有效性，为发现新型防辐射损伤化学结构提供了方法学参考。