UPLC波长切换法同时测定桑叶中6种指标成分的含量

邓明慧，冯 玉，路 娟，柴瑞平，赵 颖，俞 月，吕欣锴，陈 曦,，李海涛

（1.山东中医药大学，山东 济南 250355；2.中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所，北京100193；3.中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所云南分所，云南 景洪 666100）

桑叶为桑科植物桑（Morus albaL.）的干燥叶，性味甘、苦、寒，归肺、肝经，具有疏散风热，清肺润燥，清肝明目的功效，用于风热感冒，肺热燥咳，头晕头痛，目赤昏花等症[1]。桑叶药用始载于《五十二病方》[2]。桑叶产地丰富，我国东北、西南、西北各省区均有栽培，中亚各国、欧洲、印度等地均有栽培[3]。桑叶中含黄酮类、酚酸类、生物碱类、香豆素类、氨基酸、多糖等化学成分[4-10]，其中多种成分具有良好生物活性。现代药理研究表明，桑叶具有抗炎、降低毛细血管脆性、降血压、抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、抗过敏、抗动脉粥样硬化、抗脂质过氧化等作用[4-10]，芦丁、紫云英苷具有抗炎、抗氧化作用；异槲皮苷具有降压、抗炎、抗氧化、抗抑郁作用；绿原酸具有清除自由基、抗脂质过氧化、抗菌、抗病毒、抗诱变等作用[11-14]。中药的活性成分是多个成分的复合体，2015 年版《中国药典》中桑叶指标成分为芦丁[1]，未测定其他成分含量，但单一成分无法全面反映桑叶整体质量。本研究采用超高效液相色谱（UPLC）测定不同产地新绿原酸、隐绿原酸、绿原酸、芦丁、异槲皮苷、紫云英苷6种活性成分的含量，为桑叶质量标准控制和含桑叶的成药制剂质量控制提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Waters UPLC H-Class系统，含四元溶剂泵、自动进样装置、在线真空脱气装置、PDA检测器、Empower 2色谱工作站（美国沃特世）；AB265-S分析天平（瑞士Mettler公司）；KQ-250E型超声波清洗器（昆山超声仪器公司）；高速万能粉碎机（上海顶帅电器有限公司）。

1.2 试药

新绿原酸（批号：170916），隐绿原酸 （批号：171016），芦丁（批号：160423），绿原酸（批号：180301），异槲皮苷（批号：160730），紫云英苷（批号：190503，上海融合医药技术有限公司）；乙腈（德国Merck），磷酸（阿拉丁），均为色谱纯；蒸馏水（屈臣氏）。

桑叶药材为药材市场、药店购买，经中国医学科学院药用植物研究所云南分所李海涛教授鉴定均为桑（Morus albaL.）干燥叶。标本保存于中国医学科学院药用植物研究所化学楼106室。样品信息见表1。

表1 桑叶样品信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性

BEH shield RP18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；以乙腈（A）-0.1 %磷酸（B）为流动相，梯度洗脱：0～2.5 min，15 %～16 %A；2.5～2.6 min，16 %～25 %A；2.6～7 min，25 %～27 %A；7～8 min，27 %A～100 %A。流速0.3 ml/min，柱温40 ℃，进样量2 µl，检测波长0～3 min 325 nm，3～8 min 358 nm。结果新绿原酸、隐绿原酸、绿原酸、芦丁、异槲皮苷、紫云英苷各峰之间分离度良好，分离度均＞1.5，理论板数按芦丁峰计算＞100 000。对照品溶液与供试品溶液的UPLC图谱见图1。

图1 对照品溶液与供试品溶液的UPLC色图谱

2.2 溶液的制备

2.2.1 供试品溶液的制备 桑叶粉碎，过60目筛，取约0.5 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入70 %甲醇25 ml，称定重量，90 ℃回流提取30 min，放冷，再次称定重量，用70 %甲醇补足补减矢的重量，摇匀，滤过，续滤液过0.22 μm微孔滤膜，即得。

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取新绿原酸、隐绿原酸、绿原酸、芦丁、异槲皮苷、紫云英苷对照品适量，用70 %甲醇溶解定容，配制成浓度为1 mg/ml的对照品贮备溶液。分别精密吸取新绿原酸对照品贮备溶液0.8 ml、隐绿原酸对照品贮备溶液1 ml、绿原酸对照品贮备溶液1.2 ml、芦丁对照品贮备溶液0.6 ml、异槲皮苷对照品贮备溶液0.6 ml、紫云英苷对照品贮备溶液0.15 ml，置10 ml量瓶中，加70 %甲醇定容，制得新绿原酸80 μg/ml、隐绿原酸100 μg/ml、绿原酸120 μg/ml、芦丁60 μg/ml、异槲皮苷60 μg/ml、紫云英苷15 μg/ml混合对照品溶液，4 ℃存放备用，测定前使用 0.22 μm微孔滤膜滤过。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察 分别吸取2.2.2项下混合对照品溶液0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1 ml于1 ml量瓶，用70 %甲醇逐级稀释成不同浓度的混合对照品溶液，分别进样2 μl，以峰面积（Y）为纵坐标，以相应的对照品质量浓度（X）为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。见表2。

2.3.2 精密度试验 精密吸取供试品溶液，按2.1项色谱条件重复进样6次，测定峰面积。结果新绿原酸、隐绿原酸、绿原酸、芦丁、异槲皮苷、紫云英苷峰面积的RSD分别为2.8 %，2.2 %，1.5 %，1.5 %，2.1 %，1.8 %。结果表明精密度良好。

2.3.3 稳定性试验 取桑叶供试品溶液，按2.1项色谱条件，分别于 0，2，4，6，8 ，12，24 h 测定峰面积。根据峰面积，计算各成分含量。样品中新绿原酸、隐绿原酸、绿原酸、芦丁、异槲皮苷、紫云英苷含量RSD分别为 2.4 %，2.2 %，1.7 %，1.6 %，1.8 %，2.1 %，表明样品溶液在 24 h 内基本稳定。

2.3.4 重复性试验 取桑叶样品，按 2.2.1项下方法平行制备 6 份溶液，按2.1 项色谱条件进样分析，结果新绿原酸、隐绿原酸、绿原酸、芦丁、异槲皮苷、紫云英苷含量RSD分别为 1.7 %，1.5 %，1.6 %，2.1 %，2.7 %，1.8 %。结果表明方法重复性良好。

2.3.5 加样回收率试验 精密称取桑叶粉末 0.25 g，平行6份，分别精密加入新绿原酸、隐绿原酸、绿原酸、芦丁、异槲皮苷、紫云英苷对照品甲醇溶液（浓度分别为0.4000，0.5000，1.5000，0.6000，0.7000，0.3000 mg/ml）1 ml，按 2.2.1项下方法制备供试品溶液，按2.1项色谱条件测定各成分含量，计算平均加样回收率和RSD值，见表3。

2.4 样品含量测定

分别精密称取不同产地的桑叶，按 2.2.1项方法制备供试品溶液，平行3份，按2.1项色谱条件进样，测定峰面积，计算新绿原酸、隐绿原酸、绿原酸、芦丁、异槲皮苷、紫云英苷的含量。结果见表4。

表3 桑叶加样回收率试验结果

表4 11批桑叶6种成分含量

3 结论

中药的活性成分是多个成分的复合体。桑叶现行标准中含量测定中仅对单一黄酮类成分芦丁进行了含量控制，而未控制对其他成分的量，不能真实反映桑叶质量优劣。本试验建立的 UPLC 法具有快速，灵敏，重复性好等优点，能准确测定桑叶中6种黄酮类、酚酸类成分，初步判别桑叶药材质量，为桑叶质量控制的进一步完善提供依据。