富硒杏鲍菇液体菌种深层发酵条件优化

方玲 汤强 韩永斌

富硒杏鲍菇液体菌种深层发酵条件优化

方玲1汤强1韩永斌2

（1.芜湖职业技术学院生物工程学院，安徽芜湖，241003；2.南京农业大学，江苏南京，210095）

不同的发酵条件对杏鲍菇Pe-6菌株的深层发酵有不同的影响。在温度为25℃、初始pH为6.0、接种量为12%、装液量为40%的培养条件下，Pe-6杏鲍菇的菌丝体生物量和硒含量最大。同时，试验结果表明，最佳碳源为葡萄糖，最佳氮源为黄豆粉，最佳无机盐为KH2PO4和MgSO4·7H2O。最终的正交实验得出杏鲍菇液体发酵最优培养基组合为：2%葡萄糖、3%黄豆粉、0.1% KH2PO4及0.05% MgSO4·7H2O。采用上述研究分析得出的最优培养基开展验证实验，得出菌丝体生物量为10.15 mg/mL，较培养基优化前的数值提高29.13%；菌株硒含量为2138.52 μg/g，较优化前的1642.36 μg/g提高了30.21%。

富硒杏鲍菇；发酵条件；深层发酵。

硒对人体最主要的功能为提高免疫力、抗氧化以及抗癌作用。当前，利用食用菌开发大量富硒保健食品和药品的研究纷纷涌现[1,2]。杏鲍菇是联合国粮农组织向全世界推荐的食用菌品种，具有巨大的推广应用价值[6]。利用杏鲍菇液体发酵培养替代固体种子栽培生产，具有接种便捷、生产周期短和不易污染等优点；得到的次生代谢产物含量更高，代谢产物种类丰富，具备更强的生物学功能，最终产品的形式更加适应市场的需求[3]。因此，本研究以杏鲍菇为研究对象，利用深层发酵工艺，进行深入的理论分析和实验研究，对富硒杏鲍菇液体菌种深层发酵条件进行优化，提高富硒率，为进一步研究杏鲍菇硒含量奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1供试菌株

前期菌种筛选得到最优杏鲍菇菌株：Pe-6。

1.1.2液体基本培养基

培养基组分：2%葡萄糖、1%酵母粉、2%黄豆粉、0.05 % MgSO4·7H2O和0.05 % KH2PO4。

1.2 实验方法

1.2.1培养条件筛选优化

1.2.1.1 培养温度对杏鲍菇菌株Pe-6硒含量产量及生物量的影响

将接种菌株Pe-6分别置于20 ℃、22 ℃、25 ℃、28 ℃和30 ℃不同温度下的液体培养基中进行培养，添加50 μg/g浓度的硒含量，接种量统一为10 %，pH自然（pH为6.5 ～ 7.0，下同），150 r/min下振荡培养7天，测其菌丝体生物量和富硒量。

1.2.1.2 接种量对杏鲍菇菌株Pe-6硒含量产量及生物量的影响

分别以8%、10%、12%、14%和16%的接种量将菌株Pe-6接入液体培养基，添加50 μg/g浓度的硒含量；在25 ℃、pH自然、150 r/min 的条件下培养7天，测其菌丝体生物量和富硒量。

1.2.1.3 初始 pH 值对杏鲍菇菌株Pe-6硒含量产量及生物量的影响

将培养基初始pH 值分别调至4.5、5.0、5.5、6.0和6.5，添加50 μg/g浓度的硒含量；在25 ℃、pH自然、150 r/min 的条件下培养7天，测其菌丝体生物量和富硒量。

1.2.2基质配方筛选优化

1.2.2.1碳源筛选

将浓度2%的葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖和玉米粉加入碳源基础培养基中，装液量100 mL/250 mL三角瓶，12%的接种量，添加50 μg/g浓度的硒含量；在pH 6.0，25 ℃，150 r/min 的条件下培养7天，测其菌丝体生物量和富硒量。

1.2.2.2 氮源筛选

分别选用蚕蛹粉、酵母浸出粉、黄豆粉、蛋白胨和麸皮作为氮源，按照浓度2%加入氮源基础培养基中，装液量40%，接种量为12%，添加50 μg/g浓度的硒含量，在pH 6.0、25 ℃、150 r/min的条件下培养7天，测其菌丝体生物量和富硒量。

1.2.2.3 无机盐筛选

选用浓度0.05%的NaH2PO4、KH2PO4、KCl、K2HPO4和MgSO4·7H2O加入无机盐基础培养基中，装液量100 mL/250 mL三角瓶，12%接种量，添加硒含量的浓度为50 μg/g，在pH值6.0、25 ℃、150 r/min的条件下振荡培养7天，测量菌丝体生物量和富硒量。

1.2.2.4 正交试验优化

根据上述单因素优化试验结果，通过DPS软件进行试验设计复选，并以生物量和硒含量为指标，最终得到最佳培养基组合配方。（详见表1）

表1 基质配方正交试验设计因素水平表L9（34）

2 结果与分析

2.1 培养条件优化

2.1.1不同培养温度对菌丝体生物量和富硒量的影响

食用菌菌丝的生长受温度影响较大。温度升高，菌体生长加速；温度过高也会对菌体的生长和硒含量的形成产生负面影响[4]。

培养温度优化实验由表2得出，25 ℃时，可以得到最大菌体生物量，达到7.05 mg/mL；随着温度不断升高，生物量逐渐下降。但在28℃时硒含量却达到最大值1320.62 μg/g，与25 ℃时的产量1289.47 μg/g相比产量值相差较小。故经综合考虑，最终确定最佳培养温度为25 ℃。

2.1.2 不同接种量对菌丝体生物量和富硒量的影响

分别以10%、12%、14%、16%和18%5个不同接种量浓度接种菌株，实验最终结果见表3。结果显示，接种量达到10%时得到的生物量最少，接种量达到18%时得到的生物量高；当接种量为12%时，其硒含量达到最高值1263.42 μg/g。综合考虑生物量和富硒量，最终选择的最优接种量为12%。

表3 接种量对菌丝体生物量和富硒量的影响

2.1.3 不同培养基初始 pH 值对菌丝体生物量和富硒量的影响

由表4可以看出，起始pH为6.0时，该菌株的生物量和硒含量的产量最高，分别达到7.36 mg/mL 和1386.52 μg/g，与其他组差异达极显著水平（P < 0.01），其余依次为pH值为5.0、7.0、4.0和8.0时的产量。当pH在5.0 ～ 6.0之间时，菌株产生的富硒量在1267.26 μg/g以上；当pH大于6.0时，富硒量明显下降；在pH为8.0时，富硒量仅为829.38μg/g。

表4 不同初始pH值对菌丝体生物量和富硒量的影响

2.2 培养基成分的优化

2.2.1不同碳源、氮源、无机盐对菌丝体生物量和富硒量的影响

以菌丝体生物量和硒含量为指标对杏鲍菇液体菌种培养基的碳源、氮源以及无机盐进行筛选，结果见表5、表6和表7。

表5 不同碳源对对菌丝体生物量和富硒量的影响

表6 不同氮源对菌丝体生物量和富硒量的影响

表7 无机盐对对菌丝体生物量和富硒量的影响

从表5得出，葡萄糖为碳源时，菌株Pe-6硒含量的产量达到最高，为1876.45 μg/g，生物量也较高，因此确定最佳碳源为葡萄糖。从表6得出，以黄豆粉为氮源培养时，综合考虑生物量和硒含量的产量，并从原料价格角度考虑，最终确定富硒培养基的最佳氮源为黄豆粉。从表7可以看出，综合考虑生物量和硒含量的产量，确定KH2PO4和MgSO4·5H2O为最佳无机盐。因此，正交试验的重要影响因子为葡萄糖、黄豆粉、KH2PO4和MgSO4·5H2O。

2.2.2正交试验确定发酵培养基的最佳组合

通过正交实验得出（表8），四个因素对菌株Pe-6菌丝体生物量的影响大小分别依次为：黄豆粉（B）> 葡萄糖（A）> MgSO4·5H2O（D）> KH2PO4（C）。统计分析结果表明：在以生物量为指标试验中，四个因素的最佳组合为A2B2C3D1，菌丝体生物量达到10.15 mg/mL，与其他组差异达极显著水平（P < 0.01），最佳培养基组成为2%葡萄糖、3%黄豆粉、0.05% MgSO4·7H2O及0.025% KH2PO4。

表8 生物量直观分析结果

从表9可以看出，试验中选择的四个因素对硒产量的影响大小依次是：葡萄糖（A）> MgSO4·5H2O（D）>黄豆粉（B）> KH2PO4（C）。统计分析结果表明，试验中四个因素的最佳组合为A2B3C1D2，即2%葡萄糖、3%黄豆粉、0.1% KH2PO4和0.05% MgSO4·7H2O，此种组分的培养基为硒产量达到最佳时的培养基。

表9 以富硒量为指标的正交表及直观分析结果

综合考虑上述菌丝体生物量、硒含量，以及生产成本等因素，最佳杏鲍菇富硒的培养基组成为：2%葡萄糖、3%黄豆粉、0.1% KH2PO40和0.05% MgSO4·7H2O。

2.2.3验证试验

采用上述优化得到的最佳培养基组合进行验证，结果得到菌丝体生物量为10.15 mg/mL，比优化前的7.86 mg/mL提高了29.13%。数据统计分析显示，两者之间具有极显著差异；同时，菌株硒含量产量为2138.52 μg/g，比优化前的数值提高了30.21%，两者之间具有极显著差异。

3 讨论

目前，国内对于杏鲍菇的研究主要以子实体居多，但子实体栽培存在成本高、周期长等缺点，在某种程度上限制了杏鲍菇研究的广泛推广[5]。相较而言，液体深层发酵培养表现出出菇质量高、生产周期短、菌丝萌发快等显著优势，大大降低了生产成本。并且，大量研究表明在营养成分及含量方面食用菌子实体和菌丝体差异较小[7]。利用发酵技术生产出富硒食用菌，继而加工成为补硒的功能食品、保健品和药品，己被证实为目前为止最安全可靠的技术方法[8-9]。因此，改变传统杏鲍菇菌种生产工艺、推广液体培养，可以促进杏鲍菇产业的全面升级。

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Optimization of the Conditions for Deep Fermentation of Se-enriched Pleurotus Eryngii

FANG Ling & TANG Qiang & HAN Yongbing

The different fermentation conditions have different influence on deep fermentation of Pleurotus eryngii Pe-6 strain. In the condition of the culture temperature 25 ℃, initial pH 6.0 naturally, inoculum size 12% and loaded liquid 40%, mycelia biomass and Se-content of Pleurotus eryngii Pe-6 strain were maximized. Meanwhile, experiment results show that the best carbon source is glucose; the best nitrogen source is soybean meal; the best inorganic salts are KH2PO4and MgSO4·7H2O. Finally, the orthogonal experiment proves that the best medium for Pleurotus eryngii submerged fermentation medium consists of 2% glucose, 3% soybean meal, 0.1% KH2PO4and 0.05% MgSO4.7H2O. Through the verified experiment in which the best medium mentioned above was adopted, the results show that the mycelia biomass weights 10.15 mg/mL, 29.13% compared with the value before optimization; the Se-content reaches up to 2138.52 μg/g, improving by 30.21% compared with 1642.36 μg/g before optimization.

Se-enriched Pleurotus eryngii; fermentation conditions; deep fermentation.

S318

A

1009-1114（2020）04-0015-05

2020-05-20

1. 方玲（1982—），女，安徽蒙城人，硕士，芜湖职业技术学院讲师，研究方向为食用菌开发及其教学。

2. 汤强（1981—），安徽芜湖人，博士，芜湖职业技术学院教授，研究方向为微生物学。

研究项目：安徽省高校自然科学研究重点项目（KJ2017A556）；安徽省教育厅质量工程教学研究重点项目（2018jyxm0177）；安徽省教育厅质量工程校企合作示范实训中心项目（2019xqsxzx15）。

文稿责编 萧晟