鼻咽癌肝转移患者Zta 蛋白表达与EB-DNA检测相关性研究＊

邹嵩，汪琛

（江西省赣州市人民医院，1.微创介入科；2.肿瘤科，赣州341000）

鼻 咽 癌(Nasopharyngeal Carcinoma，NPC)在 我国属于常见恶性肿瘤， 其发病存在一定的地域因素，多发于广东、江西、广西等地，其中70%-80%的患者初诊就合并颈部转移淋巴结， 更为严重的是，有6%-15%的患者初诊时即出现远处转移[1-4]。鼻咽癌与EB 病毒（EBV）存在着密切的关联，存在研究表明[5]，在NPC 患者的早期诊断、临床分析和监测疗效、 复发或转移以及预后预测中， 血浆EBV-DNA 检测都具有其重要的临床价值。 Zta 蛋白是EBV 立即早期基因BZLF1 编码的蛋白，该蛋白通过调控病毒基因使病毒顺利的复制、 包装、感染，同时Zta 也调控了细胞内基因，影响了细胞增殖、生长、分化、凋亡，并且能够使得裂解感染期基因疯狂表达，使得鼻咽部上皮细胞产生癌变[6]。 目前， 已存在一些关于EB-DNA 检测对鼻咽癌诊断价值的研究，但在Zta 蛋白方面的研究较少。 本研究通过明确鼻咽癌肝转移患者血清EBV-DNA 与Zta 蛋白表达的关系，进而探讨一种治疗EBV 感染疾病时针对Zta 蛋白的靶向治疗方法， 为EBV 感染以及针对Zta 蛋白的靶向治疗方法奠定基础，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2017 年6 月-2019 年6 月间我院诊断为初治鼻咽癌的患者40 例纳入本研究，其中男26 例，女14 例；年龄20-70 岁，平均（47.35±10.17） 岁； 肿瘤最大径：≤3cm 者29 例，＞3cm 者11例； 转移瘤数目：≤3 个者31 例，＞3cm 者9 例；未分化非角化鳞癌6 例、低分化鳞癌15 例、中分化鳞癌19 例；Child-Pugh 分级[7]：A 级32 例、B 级8例。 纳入标准：鼻咽癌患者并于我院经影像学检查确诊发生肝转移患者；肿瘤最大径≤5cm；肝转移肿瘤数≤5 个；知情并签署知情同意书。 本研究经我院伦理委员会批准。

1.2 方法 外周血EBV-DNA 检测：清晨采集鼻咽癌患者外周静脉血3mL， 并用1500r 离心机离心10 min，吸取离心后上层血浆，随后按DNA 提取试剂盒指示操作，提取的DNA 加入缓冲液至-20℃冰箱保存，用荧光定量PCR 仪（美国ABI 7900）检测EBV-DNA 表达。

酶联免疫吸附法（ELISA）检测：实验血清样本采用含2%小牛血清的磷酸缓冲盐溶液稀释，Zta-IgG 和Zta-IgA 的检测浓度分别为1：200 和1：20，随后在每孔种加入100μl 稀释血清。 在37℃下孵育1h， 经缓冲液冲洗5 遍后再加入标记后的IgG和IgA 抗体，再次孵育、冲洗，加入显色剂37℃显色15min，终止显色后用酶标仪（Thermo Scientific Varioskan LUX）检测吸光度。

1.3 观察指标 比较不同性别、 不同肿瘤最大径、不同转移瘤数目以及不同分级患者EBV-DNA 拷贝数；统计患者Zta-IgG 和Zta-IgA 的相对光密度值，并分析其与EBV-DNA 水平的相关性。

1.4 统计学方法 采用SPSS17.0 统计软件建立完整数据库， 计量资料以均数±标准差的方式表达，用t 检验法进行比较，对鼻咽癌肝转移进行多因素分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料 EBV-DNA 拷贝数差异情况 男性患者、肿瘤最大径＞3cm、转移瘤数目＞3 以及Child-Pugh 分级为B 级的患者EBV-DNA 拷贝数略高于女性、肿瘤最大径≤3cm、转移瘤数目≤3 以及分级为A 级的患者,差异无明显差异(P＞0.05),见表1。

2.2 鼻咽癌肝转移多因素分析 分析结果显示，肿瘤最大径＞3cm、转移瘤数目＞3 以及Child-Pugh 分级（B 级）是鼻咽癌肝转移患者的危险因素，（OR＞1，P＜0.05），详见表2。

表1 患者一般资料EBV-DNA 拷贝数差异比较

表2 鼻咽癌肝转移多因素分析

2.3 患者zta 蛋白表达与EBV-DNA 水平的相关性分析 患者Zta-IgG 和Zta-IgA 的相对光密度分别为（1.63±1.04）和（1.71±1.07），相关性分析结果显示Zta-IgG、Zta-IgA 与EBV-DNA 水平均为正相关（r=0.187，P=0.023；r=0.213，P=0.017），见表3。

表3 患者zta 蛋白表达与EBV-DNA 水平的相关性

3 讨论

大部分NPC 患者癌细胞中均检测存在EBV基因组成分，并且有研究表明[8]NPC 患者外周血中EBV-DNA 水平会随肿瘤消长而发生变化，EBVDNA 检测能有效监测NPC 的发生、发展情况。 Lin等[9]通过比较99 例NPC 患者血浆和原发肿瘤的EBV 基因型，并且对PCR 产物进行测序，从而证实了整合了EBV 的鼻咽癌细胞是血浆EBV-DNA 的主要来源。Wang 等[10]通过PET-CT 结合EBV-DNA检测对经过治疗后的NPC 患者进行了随访， 发现治疗后血浆中可检测到EBV-DNA 水平的36 患者均出现了NPC 复发， 而未检测到EBV-DNA 水平的5 例患者均未出现NPC 的复发， 并且该方法的灵敏度优于PET-CT。 与治疗前血浆EBV-DNA 水平相比， 治疗后EBV-DNA 水平对于NPC 的复发转移具有更大的预测意义， 尤其是治疗后患者血浆EBV-DNA 水平能否及时降到0 直接关系到NPC 的复发[11]。 并且，有相关研究表明EBV-DNA水平与我国2008 TNM 分期呈正相关。 目前，有关于EBV-DNA 具体的入血机制尚未完全被人们了解，但以下两种机制被大多数人接受：其中一种机制认为，血浆EBV-DNA 水平与肿瘤细胞凋亡数呈现正相关关系，在细胞凋亡时，DNA 通常被脱氧核苷酸酶切割裂解，形成181 bp 以内的小片段，故猜想其入血与细胞凋亡裂解可能存在一定的关联；另一种机制认为，EB 病毒通过潜伏周期转变为溶解复制周期以后，对细胞结构、周期，染色体变化以及宿主细胞毒性T 淋巴细胞的免疫识别均会产生较大的影响[12]。

EBV 在裂解期所表达的病毒蛋白可分为立早蛋白、早期蛋白以及晚期蛋白3 类。 其中，早期蛋白与病毒DNA 复制有关，晚期蛋白与病毒包装有关，而立早蛋白则主要负责前2 种蛋白的转录，在EBV 进入裂解期起着关键的作用。 Zta 蛋白就是EBV 立早基因BZLF1 编码的蛋白， 同时也是最重要对的立早蛋白之一， 并且该蛋白能够促进早期和晚期蛋白的疯狂转录表达， 使得EBV 由潜伏期进入裂解期[13]。 近年来，有研究发现，Zta 蛋白不仅仅会影响病毒蛋白的表达， 甚至通过多途径影响着宿主蛋白的表达。 一方面， 该蛋白具有螺旋结构，可与宿主细胞蛋白发生作用；另一方面，该蛋白与AP1 家族具有同源性， 能够与宿主细胞基因启动子发生结合，进而影响宿主细胞蛋白的表达、转录[14,15]。

本研究对鼻咽癌肝转移患者一般资料EBVDNA 拷贝数进行比较， 结果提示鼻咽癌患者发生肝转移后，在肿瘤转移数目、肿瘤最大径之间存在差异时，其EBV-DNA 拷贝数并无明显差异（P＞0.05）， 而有研究显示未发生转移患者EBV-DNA 拷贝数明显低于转移患者。 而多因素分析结果显示，肿瘤最大径＞3cm、 转移瘤数目＞3 以及Child-Pugh分级（B 级）均是鼻咽癌肝转移患者的危险因素，并且相关性分析结果显示，Zta 蛋白表达与EBVDNA 水平呈正相关， 可见患者Zta 蛋白与EBVDNA 水平均可作为评价鼻咽癌肝转移的指标。

综上所述，Zta 蛋白和EBV-DNA 水平均可作为诊断EBV 感染的指标，在临床上对于EBV 的预防与治疗具有较高的应用价值。