新型季铵盐戊二醛消毒液杀菌效果评价

何淑华，许 琦，林晓雁，卢朝成，傅江南，和 君

(1.暨南大学实验动物管理中心，广东 广州 510632；2.成都中牧生物药业有限公司，四川 成都 610100)

消毒工作是实验动物管理的关键环节，是实验动物工作的基础保障。从业人员只有使用正确配比的消毒剂才能达到消毒效果，才能在生产、试验过程中把控实验动物的质量，规范实验动物的安全管理[1]。因此，消毒工作是控制环境中病原的关键。目前，实验动物屏障环境中常见的消毒剂种类包括含氯类、过氧化物类、醛类、醇类和季铵盐类消毒剂[2]。单一消毒剂易受微生物的种类、使用浓度、环境中有机物等因素的影响而不能达到预期的效果，复合型消毒剂可避免此类问题达到好的杀灭效果[3-4]。本试验对一种新型三组方季铵盐戊二醛消毒剂进行杀菌效果评价，选用4种常用消毒剂进行喷雾消毒对比试验[5]；与复合过氧乙酸进行悬液定量杀菌对比试验。本试验结果对实验动物设施的消毒剂选择及有效配比提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验组消毒液 复合过氧乙酸 (Compound peracetic acid disinfectant,CPAA)，有效成分：过氧乙酸30～60 g/L、过氧化氢220～280 g/L；季铵盐戊二醛 (Quaternary ammonium salt glutaraldehyde disinfectant,QASG)，主要成分：苯扎氯铵16 g/L、癸甲溴铵24 g/L、戊二醛20 g/L，用前加无水碳酸钠20 g/L进行碱化；漂白水，主要成分：次氯酸钠和氢氧化钠；微酸性次氯酸，有效氯含量60～80 mg/L；乙醇，含量为(950±50) mL/L。以上产品均为市售产品。

1.1.2 菌种 大肠埃希菌 ATCC 8099、金黄色葡萄球菌 ATCC 6538、绿脓杆菌 ATCC 15442、白色念珠菌 ATCC 10231，均购自广东环凯微生物科技有限公司。

1.1.3 培养基与试剂 胰蛋白胨大豆肉汤 (TSB)、胰蛋白胨大豆琼脂 (TSA)、液体沙氏培养基，购自青岛海博生物技术有限公司；马铃薯葡萄糖琼脂培养基 (PDA)，购自广东环凯微生物科技有限公司；标准硬水、胰蛋白胨生理盐水溶液 (TPS)、3%牛血清白蛋白 (BSA)，参照 《消毒技术规范》[5](简称《规范》) 配制；复合过氧乙酸和季铵盐戊二醛的中和剂参照文献[6-7]。

1.2 方法

1.2.1 喷雾消毒试验 取普通环境实验室桌面自然菌接种于TSB，37 ℃培养18 h，稀释麦氏比浊度 (McF) 为0.5的菌悬液，104倍稀释，取0.2 mL/皿涂布于TSA制成染菌皿 (染菌量250～300 CFU/皿)。5种消毒剂参照说明书的最高消毒浓度 (复合过氧乙酸1∶24倍稀释、季铵盐戊二醛1∶100倍稀释、漂白水6∶190倍稀释、微酸性次氯酸原液、乙醇100∶26倍稀释) 进行喷雾试验，为确保喷雾消毒剂量的一致性，以固定喷头、喷洒距离来实现。37 ℃倒置培养24 h，计算菌落数，按下式计算杀灭率 (%)。

杀灭率= (试验组菌落数-阳性对照菌落数)/阳性对照菌落数×100%

1.2.2 试验菌悬液的制备 参照 《规范》，复苏菌种培养至3代，分别取E.coil、S.aureus、P.aeruginosa单菌落接种TSA斜面37 ℃培养24 h；C.albicans接种于PDA斜面26 ℃培养48 h。用TPS洗脱斜面培养物，使各菌为E.coil1.9 McF、S.aureus2.0 McF、P.aeruginosa2.1 McF、C.albicans6.9 McF。

1.2.3 活菌培养计数 参照 《规范》将E.coil、S.aureus、P.aeruginosa在TSA中37 ℃培养48 h，C.albicans在PDA中26 ℃培养72 h，计算菌浓度 (CFU/mL)。

1.2.4 中和剂鉴定试验 以E.coil和C.albicans为试验菌，室温下按中和剂悬液定量鉴定试验设计6组，参照《规范》进行试验：第1组 (消毒液+菌悬液)；第2组 (消毒液+菌悬液+中和剂)；第3组 (中和剂+标准硬水+菌悬液)；第4组 (中和产物+菌悬液)；第5组 (TPS+标准硬水+菌悬液)；第6组 (TPS+中和剂+标准硬水)。试验重复3次，计算各组的菌落数，按下式计算第3、4、5组间菌落数误差率。

Pz=(∑︱X-Xi︱)÷(∑Xi)×100%

Pz：组间菌落数误差率；X：3组间菌落平均数；Xi：各组菌落平均数

1.2.5 悬液定量杀菌试验 参照《规范》，室温下比较复合过氧乙酸和季铵盐戊二醛不同浓度下对E.coil、S.aureus、P.aeruginosa和C.albicans的定量杀菌效果。消毒液的稀释度为 1∶100、1∶500和1∶1 000，消毒液与标准硬水以 1.25∶100、1.25∶500 和 1.25∶1 000 配制。0.5 mL 菌悬液和 0.5 mL 3%BSA 混匀后加入 4 mL 配制浓度的消毒液，混匀30 min 后，取 0.5 mL 试验菌、消毒混合液加入4.5 mL中和剂中，混匀作用10 min，取 1 mL 该样液计算菌落数，试验独立重复3次；同时设立对照组。计算杀灭对数值 (KL)。

KL=lg(T0)-lg(Tx)

KL：杀灭对数值；T0：阳性对照组平均活菌浓度；Tx：试验组平均活菌浓度

1.2.6 pH测定 参照《规范》“pH测定法”测定复合过氧乙酸及季铵盐戊二醛的不同稀释度的pH。

2 结果

2.1 喷雾消毒 喷雾试验结果显示(见中插彩版图1)，季铵盐戊二醛 1∶100倍稀释和复合过氧乙酸 1∶24倍稀释的杀灭率均为100%，漂白水 6∶190倍稀释、微酸性次氯酸原液、乙醇 100∶26倍稀释的杀灭率分别为59%、37%和50%。

图1 5种消毒剂喷雾后表面菌落的生长情况Fig.1 Growth of surface colonies after spraying five disinfectantsA：阳性对照；B：漂白水；C：季铵盐戊二醛；D：微酸性次氯酸；E：乙醇；F：复合过氧乙酸A:Positive control;B:Bleach;C:QASG;D:Slightly acidic hypochlorous acid;E:Ethanol;F:CPAA

2.2 中和剂鉴定 参照《规范》和赵斌秀等[8]发表的中和剂合格标准，1组无菌生长，2组比1、3、4、5组菌数量显著减少，3、4、5组间菌落数误差率不超过15%，6组无菌生长，中和剂鉴定合格，结果见表1。所用中和剂均能有效中和消毒液，且中和剂、中和产物对E.coil和C.albicans均无影响。

表1 中和剂鉴定试验结果Table 1 Results of neutralization identification test (n=3)

2.3 悬液定量杀菌 由表2所示，复合过氧乙酸1∶1 000 倍稀释对E.coil、S.aureus、P.aeruginosa的杀灭对数值均>7；季铵盐戊二醛 1∶1 000 倍稀释对S.aureus的杀灭对数值>7，1∶500倍稀释对E.coil杀灭对数值>7，1∶100 倍稀释对P.aeruginosa的杀灭对数值>7；复合过氧乙酸和季铵盐戊二醛 1∶500 倍稀释对C.albicans的杀灭对数值均>6。参照 《规范》 要求，细菌繁殖体的杀灭对数值≥5、真菌的杀灭对数值≥4，判定为消毒合格。因此，季铵盐戊二醛 1∶100 倍稀释，复合过氧乙酸 1∶500 倍稀释对所测菌株杀灭效果均可达100%，消毒合格。

表2 悬液定量杀菌试验结果Table 2 Results of suspension quantitative sterilization test

2.4 pH测定 由表3所示，季铵盐戊二醛原液呈酸性，使用前每升原液需加入20 g无水碳酸钠进行碱化，使pH达到9.7～10.0，该液的工作浓度pH在7.4～9.8；复合过氧乙酸原液呈酸性，工作浓度的pH范围在2.6～3.5。

表3 不同稀释度消毒液的pHTable 3 pH of disinfectant with different dilution

3 讨论

动物设施中，人源、动物源、物源使用不规范或管理不当均可造成外源物的污染。因此，严格做好消毒工作是保证实验动物设施洁净，获得的试验数据真实可靠的关键。本试验选用常用的复合过氧乙酸、漂白水、微酸性次氯酸、乙醇消毒液，与季铵盐戊二醛进行喷雾消毒对比试验。结果显示，复合过氧乙酸1∶24倍稀释和季铵盐戊二醛1∶100倍稀释的杀灭率均为100%。进一步以复合过氧乙酸和季铵盐戊二醛进行定量杀菌效果比较。结果显示，季铵盐戊二醛1∶100倍稀释和复合过氧乙酸1∶500倍稀释对各试验菌杀灭效率高达100%。

图2 悬液定量杀菌试验菌落生长情况Fig.2 Colony growth in suspension quantitative sterilization testP：阳性对照组；A、B、C：分别为复合过氧乙酸1∶100、1∶500、1∶1 000的稀释液试验组；D、E、F：分别为季铵盐戊二醛1∶100、1∶500、1∶1 000的稀释液试验组P:Positive control group;A,B,C:CPAA’s dilution test groups 1∶100,1∶500,1∶1 000;D,E,F:QASG’s dilution test groups 1∶100,1∶500,1∶1 000

复合型季铵盐戊二醛由苯扎氯铵、癸甲溴铵和戊二醛三方组成。戊二醛属于醛类高效消毒剂，可抑制RNA、DNA和蛋白质合成，杀灭各种微生物；苯扎氯铵、癸甲溴铵是常用的单、双链季铵盐类阳离子表面活性剂，具有良好的杀菌作用[9]。复合型季铵盐戊二醛降低了单一组分的用量，同时达到提高消毒效果、提升稳定性、减少副作用的目的[10]。同时，这类消毒剂在酸性条件下稳定储存，在碱性条件下杀灭效果好[3-4]，符合理想的化学消毒剂杀菌谱广、高效、低毒、低腐蚀、稳定的优点。

本试验在实验室条件下，检测了季铵盐戊二醛的杀灭效果，杀灭率依次为：金黄色葡萄球菌>大肠埃希菌>铜绿假单胞菌，与魏岚[11]的研究结果一致，杀灭效果符合实验室杀灭微生物试验的消毒要求[5]。本试验为各实验动物设施消毒液的选择提供依据，并为有针对性杀灭病原体提供参考。