羊支原体肺炎胶体金免疫层析检测方法的建立及应用

王 璇，潘淑惠，吴玙彤，黄 波，刘显明，宫 伟，文正常

(1.贵州省农业科学院畜牧兽医研究所，贵州 贵阳 550005；2.贵州省威宁县动物疫病预防控制中心，贵州 威宁 553100；3.贵州省威宁县畜禽品种改良站，贵州 威宁 553100)

羊支原体肺炎(Mycoplasmal pneumonia of sheep and goats，MPSG) 是由绵羊肺炎支原体(Mycoplasmaovipneumoniae，Movi)、丝状支原体山羊亚种(Mycoplasmamycoidessubsp.capri，Mmc)和山羊支原体山羊亚种(Mycoplasmacapricolumsubsp.capricolum，Mcc)等病原引起的传染病[1]。在气温骤变或长途运输应激时，较常暴发和流行[2]。根据贵州省畜牧兽医研究所对贵州部分地区非免疫羊群的羊支原体肺炎血清学调查表明[3]，羊支原体肺炎已成为影响贵州肉羊养殖的主要传染性疫病。目前，贵州肉羊专业规模化养殖相对滞后，大部分地区仍以农户小规模分散养殖为主，其分布主要在边远山区。本试验应用绵羊肺炎支原体RPS11基因重组蛋白为免疫抗原，制备了羊支原体肺炎特异性单克隆抗体，并建立了羊支原体肺炎胶体金免疫层析检测方法。研制的金标检测试纸条经特异性、敏感性、重复性等试验结果表明，对羊支原体肺炎的诊断检测具有快速、灵敏、特异及操作简便的良好特性，其使用不需要特殊的检测仪器设备及试验条件，适宜养羊生产一线对羊支原体肺炎的早期诊断和流行病学调查工作的开展。

1 材料与方法

1.1 重组蛋白抗原 抗原为绵羊肺炎支原体RPS11基因重组质粒经大肠杆菌菌株表达系统表达纯化的pET28a-RPS11蛋白，抗原表位集中区重组蛋白分子质量为19 kDa，重组蛋白纯度>85%，由贵州省畜牧兽医研究所畜禽疫病研究室制备保存。

1.2 待检抗原 Mmc和 Mcc由贵州省畜牧兽医研究所畜禽疫病研究室保存；羊支原体肺炎ELISA诊断试剂盒为贵州省畜牧兽医研究所中试产品；猪肺炎支原体、鸡滑液支原体、大肠杆菌、沙门菌及链球菌，均购自青岛立见生物公司；阴性山羊血清，购自广州蕊特生物科技有限公司。

1.3 单克隆抗体的制备 将pET28a-RPS11重组蛋白作为免疫抗原，参照何昭阳等[4]方法制备单克隆抗体，用Protein G-琼脂糖亲和层析柱(HiTrap Protein G，1 mL，Pharmacia Biotech)对所制备的单抗进行纯化，冷冻保存。

1.4 胶体金免疫层析方法的建立

1.4.1 胶体金溶液的制备 取0.01% 四氯合金酸水溶液100 mL加热煮沸，加入1%枸橼酸三钠水溶液2.5 mL煮沸至橙红色，制备成20 nm的胶体金颗粒溶液。

1.4.2 胶体金最适pH的确定 取7支1.5 mL EP管，分别加入1 mL制备好的胶体金溶液，用0.2 mol/L 碳酸钾溶液将胶体金溶液的pH分别调为6.0、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0和9.5，取50 μL 1 mg/mL 的RPS11标记单抗溶液加入上述胶体金管中，混匀后室温放20 min，然后每管分别加入100 μL 10% NaCl溶液，混匀，室温静置1～2 h，观察胶体金颜色变化，记录保持红色的最低pH。

1.4.3 标记抗体最适量的选择 采用蛋白梯度法确定RPS11标记单克隆抗体与胶体金结合的最适浓度。具体操作：取8支1.5 mL EP管，分别加入1 mL 调到最适pH的胶体金溶液，将RPS11标记单克隆抗体用纯化水稀释成1 mg/mL，各取0、5、10、20、30、40、60 μL和80 μL按顺序加入上述小试管中混匀，放置10 min后，在每一小试管中加入0.1 mL 10% NaCl水溶液，室温混匀静置2 h，观察胶体金颜色变化，记录保持红色的最低蛋白质用量。

1.4.4 胶体金探针的制备和纯化 将最适pH的胶体金溶液20 mL加入RPS11标记单克隆抗体，在室温下电磁搅拌30 min，制得胶体金-抗体结合物溶液，将10% BSA 2 mL加入制得的胶体金-抗体结合物溶液中(终浓度0.4%)，室温搅拌10 min，20 000g离心40～ 60 min，仔细吸出上清，将沉淀物溶于2 mL 1% BSA的PB液中重悬，用0.45 μm滤膜过滤，4 ℃保存备用。

1.4.5 胶体金-抗体结合物原液工作浓度的确定和金标垫的制备 用工作液将胶体金-抗体结合物原液按1∶2、1∶4、1∶8 与1∶16进行稀释，取1.4 mL胶体金-抗体结合物稀释液，均匀地加在玻璃纤维膜上，置37 ℃烤干，即为金标垫，测试后确定胶体金标记抗体的最适工作浓度。

1.4.6 检测线(T线)及质控线(C线)条件的建立和优化 将NC膜上T线及C线的包被抗体设置几个浓度梯度，选择显色效果最优的一组作为RPS11单克隆抗体使用浓度(T线)和羊抗鼠IgG抗体使用浓度(C线)。

1.4.7 T线及C线的点膜 用0.01 mol/L pH 8.0 PBS 将鼠RPS11单克隆抗体和羊抗鼠IgG抗体分别稀释至所需浓度，用划膜机在NC膜上点膜。T线与C线的距离为0.5 cm，参数均为1 μL/cm，喷好的NC膜置37～45 ℃烤干，干燥8 h以上。

1.5 胶体金试纸条的组装和结果判定

1.5.1 组装 将PVC底板切成2.8 mm×6 cm的条，在PVC底板中间粘贴抗体固相NC膜，距离上段1.5 cm，在PVC底板下端(即靠近NC膜的T线端)粘贴玻璃纤维膜探针条带，并与固相抗体NC膜重叠0.1 cm，然后在下端粘贴1.7 cm宽样本垫(玻璃纤维膜)与探针条带重叠0.1～0.2 cm，在PVC底板上端(即靠近NC膜的C线端)粘贴1.7 cm宽的吸水纸，并与抗体固相NC膜重叠0.1～0.2 cm，切成2.8 mm宽的试纸条。

1.5.2 结果判定 将随机抽取的试纸条检测卡，向加样孔中滴加60 μL处理好的待检样品，室温下反应15 min。结果判定方法如图1。

图1 胶体金试纸条的测试结果判定Fig.1 Determination of test results of colloidal gold test strip

1.6 胶体金试纸条的应用 从特异性、敏感性和重复性对试纸条进行评估。并将180份临床血清样品用试纸条和羊支原体肺炎ELISA诊断试剂盒进行检测，比较2种方法的符合率。

2 结果

2.1 单克隆抗体的制备 经细胞融合获得2株能够稳定分泌抗RPS11重组蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株，分别命名为3G9和1B6。经动物体内生产系统制备2株腹水型单抗，用已建立的间接ELISA方法测得纯化的单抗效价均高于105。亚型检测鉴定结果显示，3G9和1B6均为单一亚型IgG1；ELISA特异性检测试验结果显示，获得的2株单克隆抗体只与RPS11重组蛋白抗原呈反应阳性，而与其他比较菌株抗原蛋白无交叉反应，表明获得的单克隆抗体具有较高的特异性。

2.2 胶体金免疫层析方法的建立 经测定，当pH为7.5时，溶液颜色与胶体金溶液最为接近(表1)，且胶体金的稳定性最好。因此，确定胶体金的最适pH为7.5。经蛋白梯度法试验显示，鼠RPS11单克隆抗体稳定1 mL胶体金所需的最小抗体量为10 μg/mL。在1 mL胶体金-抗体结合物溶液中加入10% NaCl水溶液1 mL后，溶液仍为无沉淀的紫红色液体，说明制得的胶体金-抗体结合物原液具有良好的稳定性。经试验测试结果显示，当胶体金-抗体结合物原液的工作浓度为1∶4时，制得的金标垫检测效果最佳。对NC膜上T线及C线的包被抗体设置几个浓度梯度进行试验，结果表明，检测显色效果最优的一组浓度为：鼠RPS11单克隆抗体(T线上)工作浓度2 mg/mL，羊抗鼠IgG抗体(C线上)工作浓度为1 mg/mL。

表1 胶体金标记最适pH测定Table 1 Determination of optimum pH marked by colloidal gold

2.3 胶体金试纸条的结果判定 随机抽取试纸条，对RPS11标准阴性样品和标准阳性样品进行检测，结果如图2，说明制备的试纸条有效。

图2 试纸条检测结果判定Fig.2 Determination of test strip test results

2.4 胶体金试纸条的应用

2.4.1 试纸条的特异性 用试纸条对重组蛋白表达菌株等进行检测，结果如图3所示，说明试纸条对重组蛋白具有较好特异性。分别用Mmc、Mcc、猪肺炎支原体、鸡滑液支原体、大肠杆菌、沙门菌及链球菌代替绵羊支原体肺炎支原体，对试纸条特异性进行测定，结果显示，Mmc、Mcc、猪肺炎支原体、鸡滑液支原体、大肠杆菌、沙门菌、链球菌和标准绵羊肺炎支原体阴性样品仅在C线出现1条玫瑰红线；标准绵羊肺炎支原体阳性样品出现T线、C线2条玫瑰红线，说明绵羊支原体肺炎RPS11单抗胶体金试纸条不与Mmc、Mcc、猪肺炎支原体、鸡滑液支原体、大肠杆菌、沙门菌及链球菌发生交叉反应。

图3 试纸条对重组蛋白表达菌株的特异性检测Fig.3 Specific detection of test strip for recombinant protein expression strain1：空载体(质粒)；2：宿主菌株全菌蛋白；3：空载体转染菌株全菌蛋白；4：IPTG诱导前菌株全菌蛋白；5：IPTG诱导后菌株全菌蛋白；6：纯化后重组蛋白1:Empty vector;2:Whole cell protein of host strain;3:Empty vector was transfected into the whole bacterial protein;4:Whole cell protein of strain before IPTG induction;5:Whole bacterial protein induced by IPTG;6:Purified recombinant protein

2.4.2 试纸条的敏感性 将阳性抗原1∶10、1∶100、1∶1 000、1∶10 000稀释，用试纸条进行检测，最低可检出1∶1 000倍稀释的阳性抗原(浓度为3.0 mg/mL)(图4)。

图4 试纸条的敏感性Fig.4 Sensitivity of test strip1：阳性抗原1∶10；2：阳性抗原1∶100；3：阳性抗原1∶1 000；4：阳性抗原1∶10 000；5：阴性对照1:Positive antigen 1∶10;2:Positive antigen 1∶100;3:Positive antigen 1∶1 000;4:Positive antigen 1∶10 000;5:Negative control

2.4.3 试纸条的重复性 4批次试纸条检测5份羊支原体肺炎阴性样品和羊支原体肺炎阳性样品，每个样品重复检测10次，检测结果完全一致，不同批次间、同一批次内检测结果完全一致。

2.4.4 试纸条的临床应用 应用建立的胶体金试纸条和羊支原体肺炎ELISA诊断试剂盒分别对180份生产场临床血清样本进行检测(表2)。结果表明，胶体金试纸条检测阳性率为35.00%，阴性率为65.00%；ELISA阳性率为29.44%，阴性率为70.56%；两者阳性符合率为94.34%，阴性符合率为89.76%，总符合率达91.11%。

表2 180份临床血清胶体金试纸条与ELISA检测比较Table 2 Test comparison of 180 clinical serum colloidal gold test strips and ELISA test

3 讨论

胶体金免疫层析技术是20 世纪90 年代发展起来的一种以胶体金作为标记物检测特定抗原或抗体的新型固相免疫标记技术[5-6]。因该技术具有特异性、操作简便、检测快速等优点，其在兽医临床上有巨大的发展潜力和应用前景。本试验建立的羊支原体肺炎胶体金检测试纸条，具有较好的检测特异性，与ELISA试验方法相比，两者符合率达91.11%，与其他学者建立的胶体金试纸条检测符合率的结果相符[7-10]。胶体金适用于无实验室环境的任何场景，检测时间短，适用于大量样本的初步筛查，可与ELISA或PCR联合使用，更利于疫病的及时、准确诊断。

本试验制备的鼠RPS11标记单克隆抗体免疫抗原为绵羊肺炎支原体基因重组质粒pET28a-RPS11纯化蛋白，具有较强的诱导和增强宿主免疫应答的功能[11-13]。制备的鼠RPS11标记单克隆抗体与常规抗体相比较，具有单一的特异性，可与绵羊肺炎支原体选择性RPS11基因抗原决定簇发生特异性反应，且重复性较好。试验制备的胶体金检测诊断试剂，生产实际操作中，不需要特殊检测仪器，特别适合广大的基层兽医人员用于羊支原体肺炎的诊断及批量检测工作。

羊支原体肺炎的主要病原为Movi、Mmc和Mcc，本试验制备的胶体金试纸条特异性针对Movi，关于Mmc和Mcc的胶体金检测试验，有待进一步研究。