血清标志物对动脉粥样硬化脑梗死的临床价值*

肖筱婵， 陈赛男， 谭迎， 董茂龙， 钟敏

南方医科大学南方医院急诊科(广东广州 510515)

在低收入或中等收入的国家中，脑卒中是导致个体死亡和伤残的重要原因[1]，根据GBD2013卒中研究显示2013年全球约有2 570万人发生脑卒中(其中71%发生脑梗死)，650万人死于脑卒中(其中51%死于脑梗死)，1.13亿人中有58%因脑梗死而致终身残疾，有1 030万人第一次发生脑卒中(其中68%人发生脑梗死)[2]，急性脑梗死已经成为了致死或致残的第二大病因[3]。及时预防、早期干预可能可以延缓进展，甚至避免脑梗死的发生。动脉粥样硬化(AS)是已知全世界血管疾病的主要原因，包括缺血性脑卒中、缺血性心脏病及外周血管性疾病。现已确定年龄、吸烟、肥胖、高血压、糖尿病、高脂血症等因素与其相关。AS斑块中的血脂含量高、斑块破裂出血、新生血管形成、巨噬细胞和T淋巴细胞浸润常常与缺血事件相关，而颅内动脉由于缺少外弹力膜，炎症抑制剂减少导致促炎蛋白酶显著表达常更容易发生斑块不稳定和炎症改变[4]。在过去的数十年，预防脑梗死的发生已经取得了显著的成果，对已知的颈或颅内动脉粥样硬化的患者予抗血小板药物及他汀类药物预防脑血管事件发生已经形成共识，但对于无症状性高危人群缺乏有力证据证实其进展程度，经颅多普勒(TCD)为目前主要的非侵入性筛选方法。有不少证据表明血清生物标志物能预测颅内动脉粥样硬化进而预防脑梗死的发生，且关于这方面的研究不断更新，本文筛选了几种近年来的研究热点且是临床上常用的指标作一综述，探讨其在预测脑梗死方面的价值。

1 胱抑素C(CysC)

CysC是一种分子量为13 359 Da的碱性分泌型非糖化蛋白质[5]，是组织蛋白酶B、H、K、L和S的重要内源性抑制剂，由CST3基因编码，在所有组织细胞中均可恒定地转录和表达[6]。由于其可被肾小球滤过，并被近端肾小管完全重吸收且分解，无法返回血液，所以临床上主要作为评价肾功能损伤的指标[7]，与肌酐不同，CysC不受年龄、体重等因素影响，仅受甲状腺疾病及类固醇激素影响，所以它可能比血清肌酐更加敏感。

1.1 CysC与AS CysC是一种内源性半胱氨酸蛋白酶抑制剂，具有广泛的生物学作用，包括细胞增殖和调节炎症反应。在心血管疾病中，CysC在人类AS病变中的表达降低[8]，Longenecker等[9]将有内皮功能紊乱或AS的艾滋病患者的血清CysC水平与健康成人比较，结果发现前者的CysC浓度升高，且AS进展越严重CysC水平越高，其机制与血清CysC参与全身炎症和免疫激活的变化有关。2015年Xu等[10]详细探讨了CysC的病理生理作用，发现溶酶体半胱氨酸蛋白酶参与细胞外基质的形成，且大量存在于正常血管壁中，在AS和动脉瘤的血管病变中严重减少，通过对载脂蛋白E缺乏的易发AS的小鼠模型进行测试，发现其组织蛋白酶升高，表明CysC可能具有抗AS的作用。早前已有研究表明AS的形成与自噬有关[11]，接着Li等[12]从细胞水平、动物实验出发研究了CysC与AS中自噬和凋亡细胞间的关系，凋亡与自噬能力下降在AS斑块破裂与血栓形成中起关键作用。他们发现CysC缺乏的小鼠AS模型中的自噬蛋白如Atg5和LC3b的水平表达下降，并易诱导细胞凋亡，紧接着从CysC缺乏的小鼠模型中分离出巨噬细胞观察发现P62/SQSTM1(致AS蛋白)表达增加，并且通过CysC治疗可以减少氧固醇介导的脂质积累，结果表明，CysC在AS的自噬途径对抗细胞死亡中起重要的调节作用，并且与自噬蛋白表达呈正相关，与病变的进展程度呈负相关[13]，所以有AS型脑梗死患者的血清CysC也有可能呈下降趋势，但之前的研究并未描述，这可能与异质性相关。

1.2 CysC与缺血性脑卒中 先前的研究已经证实了CysC在中枢神经系统中高度表达，且高水平的CysC可作为强预测因子来预测心血管疾病(CVD)的发生[5]。CysC与慢性肾脏病、CVD及其病死率的关系已在过去数十年的多种观察性队列研究中得到证实，有趣的是CysC与CVD的关系与肾功能及其他CVD危险因素无关，使其成为预测肾功能受损患者CVD风险的重要标志[14]。van der Laan等[15]使用孟德尔随机框架描述了CysC与CVD之间的关系，其使用一组超过250 000人的组合，其中包括63 000例CVD患者，组建了一个Cystatin C孟德尔随机化联盟，对血清CysC水平与CVD风险的相关因素进行了深入研究，发现随着CysC浓度的上升，CVD风险就会增加；同时在调整过混杂因素的观察分析中还发现CysC增加与临床事件(如缺血性脑卒中，左心衰竭等)因素独立相关，但可能是由于肾功能受损的残余混杂因素，并未发现CysC与CVD之间存在独立因果关系，旨在降低CysC浓度不太可能成为预防CVD的有效手段。Yang等[16]通过病例对照研究发现急性脑梗死(AIS)患者的血清CysC水平显着高于对照组。在调整年龄、性别、高血压、糖尿病、肌酐、尿素、尿酸、三酰甘油、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)和C反应蛋白(CRP)后，发现AIS与血清CysC高度相关，表明升高的CysC是独立的风险预测因子。接着通过建立小鼠缺血性损伤脑组织模型进一步证实了这一观点，在小鼠缺血性损伤脑组织模型中，他们观察到AIS后3 d内CysC的表达水平升高，在随后的1周内CysC水平呈下降的趋势，同时，曾有研究发现通过基因敲除使CysC表达减少会加重局灶性脑缺血后的脑损伤，这一实验恰好支持这一发现。进一步说明CysC具有神经元保护作用，其机制尚未完全阐明，但后来的研究发现CysC可通过诱导自噬清除脑血管膜内的坏死物质从而抑制AS，对脑组织起保护作用。此外，Garcia等[17]将系统性红斑狼疮患者(eGFR>60)的CysC水平与仅考虑没有肾功能损害者的CysC水平相比较评估CVD风险、炎症和亚临床AS间的相关性，发现前者的血清CysC与CVD风险、炎症因子和亚临床AS强烈相关(P=0.017)，而后者的血清CysC与上述因素间无明显相关性。Winovich等[18]通过一项观察性队列研究探究CysC与老年人缺血性脑卒中相关性，结果发现CysC与老年人卒中后短期存活率及任职功能下降相关，但该研究为进一步证实为正相关或负相关，需要研究者后期探究说明。总之CysC水平升高与AS、缺血性脑卒中等风险有关，可能由于高水平的Cys-C反映了其他已确定的危险因素的持续时间和严重程度，例如既往有长期高血压病史者其肾功能一般有受影响，使其发生心脑血管事件的风险大大提高，这种间接作用可能导致其与缺血性脑卒中风险相关。也有研究开始探索CysC的靶向治疗作用，探究其能否作为一种靶向治疗药物来预防或治疗缺血性脑卒中。

2 血浆D-二聚体(D-D)与缺血性脑卒中

血浆D-D是纤维蛋白单体经活化因子ⅩⅢ交联后再经纤溶水解所产生的一种特异性降解产物，主要反应纤维蛋白溶解过程。现在临床上主要作为深静脉血栓及肺栓塞的筛查指标，由于其在高凝状态、弥漫性血管内凝血(DIC)、肾脏疾病、肿瘤或感染等情况下也可表现为阳性，所以其特异性较低，阴性预测值高。阴性时基本可以排除肺栓塞。由于这种特性，D-D一般与心源性栓塞型脑卒中有关。

早前Feinberg等[19]报道了急性卒中后患者体内D-D普遍升高并且在症状发生后2周内达到峰值，证实了血浆D-D与缺血性脑卒中存在相关性。接着Ono等[20]经病例对照研究证实了与健康成年人相比，急性缺血性脑卒中的患者血浆D-D水平升高差异有统计学意义(P<0.05)，与年龄≤65岁及年龄65～74岁患者相比，年龄>75岁的患者D-D水平更高(P<0.05)且在房颤引起的脑梗死患者中升高较明显。故先前研究已经证实D-D水平和心源性卒中显著相关，机制是由于血栓形成所致[21]。那除了心源性血栓形成型卒中，血浆D-D水平与大动脉粥样硬化型卒中有无关系呢？鲜有文献报道。2014年一项病例对照研究发现了静脉血栓与AS存在某种关联，静脉血栓患者的亚临床或有症状的AS的患病率明显高于对照组[22]。接着一项多中心横断面研究为这种关联提供了进一步令人信服的证据，在调整几个潜在混杂因素后，发现亚临床AS的患病率几乎是没有检测到静脉血栓(RVT)患者的3倍，并且AS的相关疾病(例如颈动脉狭窄程度和双侧病变)在受试者中比在没有RVT的受试者中严重得多[23]。表明缺血性脑卒中患者的D-D水平升高可能不止由于心源性栓塞引起。随后有学者发现冠状动脉粥样硬化患者在发生缺血性心脏病(IHD)前2个月血浆D-D水平更高，强调了炎症和血栓形成在引发急性冠状动脉事件中的作用，易导致斑块破裂、出血，并对IHD患者冠脉进行血管造影及病理检查发现IHD事件通常是由相对不显着的冠状动脉粥样硬化区域的斑块破裂引起的，而升高的D-D水平反映了凝血系统的活化，纤维蛋白的形成和纤溶酶对纤维蛋白的溶解，D-D的短期增加可能表明AS斑块的不稳定和血栓的形成[24]。然而没有直接说明血浆D-D水平与颅内动脉粥样硬化的关系。关于血浆D-D水平与其他缺血性脑卒中亚型之前的关系也尚存在争议。在一些研究中，无论卒中亚型如何，D-D水平与中风、卒中进展、病死率增加有关；而另一项研究显示，在排除所有卒中患者的静脉血栓形成后，使用影像学研究和调整混杂因素后，中风严重程度和脑梗死都与D-D水平无关，只有老年人与D-D水平显着相关。随后Kim等[25]对仁川圣玛丽医院的10 172例确诊非心源性因素所致缺血性脑卒中的患者进行了回顾性研究，将他们按TOAST分型分为大动脉粥样硬化型及腔隙性梗死型，且进行9个月随访，探究每个时间点的初始D-D水平升高是否有意义，以及D-D水平是否对这些患者的功能预后有显着影响。研究发现大动脉粥样硬化型的D-D水平更高且短期预后更差，其差异有统计学意义，对长期功能预后影响无差异，具体机制尚未阐明。此研究由于未排除静脉血栓形成的可能性所以可能受其影响。目前还没有文献直接证明血浆D-D与AS型脑卒中的关系，关于AS血栓形成过程中有无D-D的参与也未可知，且由于混杂因素影响，研究结果真实性也有待考量。

3 同型半胱氨酸(Hcy)

Hcy是含硫基的氨基酸，它以4种形式存在于血浆中：约1%作为游离巯基循环；70%～80%是二硫化物与血浆蛋白结合，主要是白蛋白；剩余的20%～30%与自身结合形成二聚体Hcy或与其他硫醇(包括半胱氨酸)形成Hcy混合二硫化物。总血浆(或血清)Hcy是指所有4种形式的Hcy的组合池。其代谢需要亚甲基四氢叶酸和维生素B12(蛋氨酸合成酶必须辅助因子)的辅助。

3.1 Hcy与AS 早前的横断面研究、病例对照研究及前瞻性队列研究已经发现血清总Hcy水平升高可以导致氧化应激，血管内皮细胞功能紊乱以及大动脉粥样硬化，其机制可能是Hcy通过氧化应激导致动脉损伤，破坏血管基质和增加血管平滑肌的增殖来促进AS形成[26]，Hcy是一种强有力的兴奋性神经递质，它可与N-甲基-D-天冬氨酸受体结合，导致氧化应激，细胞质钙内流，细胞凋亡和内皮功能障碍，许多研究者认为内皮功能障碍是AS形成的最早表现。在动物模型中也已经证明了高Hcy、内皮细胞功能障碍和加快的AS之间的因果关系[27]。其中由氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导人单核细胞-1(THP-1)巨噬细胞中的泡沫细胞形成是动脉粥样斑块的形成的主要原因。Jin等[28]基于此研究了Hcy致AS的机制，发现Hcy通过LXR-α介导的ABCA1和ABCG1依赖性胆固醇外流来促进巨噬细胞中的脂质积累，其中ABCA1和ABCG1已被确定是胆固醇流出的关键转运蛋白，在THP-1巨噬细胞中，Hcy通过下调ABCA1和ABCG1的mRNA和蛋白水平来抑制apoA-Ⅰ和HDL介导的胆固醇流出。胆固醇作为LDL的重要成分，通过与微生物的脂质成分结合形成复合体聚集在动脉膜内而参与AS的发生，而Hcy可使内皮细胞损伤，与附着的LDL结合形成Hcy酰基并产生抗体促进更多LDL的聚集产生AS。此外，越来越多的证据表明DNA甲基化与AS形成之间密切相关[29]，作为AS的独立危险因素，Hcy能够通过炎症反应和DNA甲基化的干扰促进AS[30]，最近研究报道了一种与AS相关的新型表观遗传修饰基因-SMAD7[31]，Hcy可通过诱导平滑肌细胞中的SMAD7启动子的高甲基化来激活核因子-κB(NF-κB)通路驱动的血管炎症反应，从而导致AS，进一步阐述了Hcy在AS中的作用[32]。Lin等[33]发现血管平滑肌表型转换在AS中起关键作用，而Hcy可通过使血管内皮细胞损伤和诱导血管平滑肌表型转换从而加速AS，其中Hcy反应性内质网状蛋白(Herp)可能起关键作用，Lin等[33]在使用HMD喂养7个月的LDL受体缺乏的小鼠中敲除Herp，然后发现其AS不再进一步加重，且沉默Herp可抑制血管平滑肌转换为合成状态，Herp缺乏还导致体内血管平滑肌细胞(VSMC)释放的细胞增殖抑制和胶原沉积减少。总之，Hcy可通过内皮细胞损伤促进低氧LDL聚集、激活炎症反应、干扰血管平滑肌合成等过程导致AS，目前已有针对高Hcy血症的治疗，说明Hcy升高是导致心脑血管疾病风险增加的重要因素。

3.2 Hcy与缺血性脑卒中 一些观察性研究表明血清Hcy水平升高是心血管事件的危险因素[34]，随后Mizrahi等[35]和Song等[36]相继报道了Hcy与急性卒中患者神经功能缺损的相关性。此外，大量的临床及临床前期数据也证实了高Hcy水平可作为认知功能缺损和痴呆[37]、脑血管病变[38]及无症状的颈动脉狭窄等这些因素所引起的血管损伤的独立预测因子以及可使缺血性脑卒中的发病风险增加[39]，其机制可能与AS有关。但关于高Hcy与脑卒中预后的相关性存在争议，一些研究者通过临床研究发现Hcy水平升高与脑卒中的不良预后有关，后面又有研究者推翻了这个结论[36，39-40]。Kwon等[41]通过一项随机双盲多中心试验证实Hcy可作为预测急性卒中患者预后的指标。Shi等[42]通过研究高Hcy与急性缺血性脑卒中患者的远期预后的关系发现总Hcy水平只在大血管病变引起的卒中中水平升高，而在小血管中处于稳定状态，从而得出了总Hcy水平升高仅仅只与大动脉粥样硬化亚型导致的卒中患者病死率有关的结论，事实上，Hcy导致血管内皮细胞损伤可直接引起血小板积聚、血栓形成，从而发生卒中事件。目前，没有直接证据支持通过降低Hcy可使CVD的风险降低，美国心脏病学会/美国心脏协会实践指南工作组(Goff 2014)和欧洲临床实践中心血管疾病预防指南(Perk 2012)发布Hcy不是CVD的因果风险因素[43]，2017年更新的Cochrane综述中通过15项随机对照试验重新评估了降低Hcy(B族维生素)水平与预防心血管事件的关系，发现治疗组患者的卒中风险降低，高治疗剂量与低治疗剂量相比无差异，但治疗组发生心肌梗死事件的风险并没有降低[44]。以上结论表明Hcy升高与缺血性脑卒中发生具有直接关联，且降低Hcy水平可降低脑梗死风险，但临床旨在治疗高Hcy血症，并未常规用于脑梗死的预防及治疗。

4 超敏C反应蛋白(hs-CRP)与AS型血管疾病

CRP是一种急性时相反应蛋白，机体受微生物入侵或组织损伤等炎症刺激后2 h开始升高，由肝细胞合成，被认为是炎症的生物标志物。而hs-CRP并不是一种新的CRP，只是测定方法更敏感，可以检测低度炎症[44]。

长久以来，关于AS的炎症假说已被各地学者所认可，其中hs-CRP被认为是可以反映AS斑块中的炎症水平的介质之一。早前Ridker等[45]对健康绝经后妇女进行前瞻性研究，评估包括hs-CRP在内的12种血清炎症生物标志物，发现hs-CRP是最重要的心血管事件预测因子，并且另一项研究发现女性高CRP-低LDL亚组的心血管事件绝对风险高于低CRP-高LDL胆固醇亚组，进一步证实了以上结论，提出继续依赖LDL胆固醇来预测心血管事件的风险，不会成为他汀类药物一级预防的最佳靶向。随着hs-CRP标准商业化分析的可行性，全球超过50个前瞻队列性研究在不同的患者中重复试验，到2010年这些数据在新兴危险因素协作组进行的荟萃分析中得到总和，在该论述中，超过160 000个人随访130万人年，对数标准化hs-CRP每增加1个标准差，未来冠心病的风险为增加1.37(95%CI1.27～1.48)和未来心血管病死率增加1.55(95%CI1.37～1.76)。由于hs-CRP可反应AS内的炎症状态，所以在一项胆固醇和复发事件(CARE)试验中主张他汀类药物也可以推荐给LDL水平已经很低但hs-CRP仍较高的患者，初步观察结果表明他汀类药物以不依赖LDL的方式降低hs-CRP，并且仅与降低LDL相比较相关风险明显减少。这一结果随后在空军/德克萨斯州冠状动脉粥样硬化预防研究(AFCAPS/TexCAPS)、普伐他汀或阿托伐他汀评估和感染治疗(PROVE IT)以及A至Z试验中得到证实，其中对于那些不仅将LDL降低至70 mg/dL以下，而且还将hs-CRP降至2 mg/L以下的患者，临床获益最大。上述数据仅将hs-CRP作为首次和复发心血管事件强有力的预测因子，并未将CRP确定为AS的致病因子，虽然局部炎症反应时CRP也可升高，但其浓度少量增加可能也与全身炎症反应有关，例如除肝细胞外，炎症因子也可刺激冠状动脉平滑肌及脂肪细胞产生CRP。然而，关于CRP的争论并未影响研究者对hs-CRP的兴趣，还将其作为心血管事件二级预防的标准。白细胞介素-6(IL-6)是诱导肝脏CRP产生的主要细胞因子，有数据表明IL-6是AS的直接促炎因子，这一数据来自孟德尔随机化研究，该研究利用受孕时随机分类的等位基因，寻求特定的遗传多态性、测量的中间表型(如hs-CRP)和确定的临床结果(如心肌梗死或中风)之间的联系，发现rs2228145和rs7529229的IL-6信号传导途径中的多态性与终身较低水平的hs-CRP以及终身较低的血管风险相关，由此可推断IL-6与血管风险有关。随后全球超过2个前瞻性研究、新兴危险因素协作组进行的荟萃分析证实：与hs-CRP一样，IL-6也与内皮功能紊乱、亚临床AS程度、未来CVD风险相关。如果IL-6被认为是AS第二信使信号传导细胞因子，那么将上游IL-1信号传导途径作为免疫调节和AS血栓形成保护的主要靶标就不足为奇了。IL-1是急性和慢性炎症中的顶端促炎介质，也是最强大的先天免疫诱导剂之一，IL-1β是IL-1的主要循环形式[46]。炎症体发挥的核心作用使得IL-1途径抑制成为延缓AS的理论目标，Canakinumab是一种靶向IL-1β的完全人单克隆抗体，对LDL或高密度脂蛋白没有影响，其可抑制炎症小体介导的IL-1β、IL-6和CRP的产生。据报道，2011年启动了大规模的Canakinumab抗炎血栓形成结果研究(CANTOS)，这项随机、双盲、安慰剂对照试验直接测试AS血栓形成的炎症假说，hs-CRP>2 mg/L的患者入组此试验，疗效主要终点是在时间-事件分析中首次发生非致死性心肌梗死、卒中或心血管原因所致的死亡，在48个月时，接受50 mg的Canakinumab组的hs-CRP较安慰剂组降低26%，150 mg的Canakinumab组的hs-CRP较安慰剂组降低37%，接受300 mg的Canakinumab组的hs-CRP较安慰剂组降低41%(P<0.001)。尽管50 mg组的原发性心血管事件风险较安慰剂组没有显著影响，但150 mg组的原发性心血管事件风险较安慰剂组降低15%，300 mg组的原发性心血管事件风险发生率与150 mg组相似[47]。这些数据证实Canakinumab的抗炎治疗在不改变血脂水平的基础上显着降低了复发性心血管事件风险[48]。这也支持实现炎症减少和降低胆固醇的双重目标将为AS血栓形成预防方面提供最大的临床益处[49]。许多前瞻性临床试验也表明，当使用他汀类药物达到低浓度的LDL胆固醇和hs-CRP时，降脂的益处最大化。通过降低hs-CRP水平可降低AS中的炎症反应从而减少心脑血管事件发生率，Zhou等[50]也通过荟萃分析得出hs-CRP水平升高与脑梗死有关，且对男性影响较大。事实上，因为他汀类药物可以降低LDL胆固醇和炎症，所以他汀类试验不能评估减轻炎症本身是否真的降低了心血管风险。一些体外和体内研究表明，CRP具有直接的促炎作用，并加速AS。然而，关于CRP在AS发展中的作用也存在冲突的结果，以及CRP是否发挥因果作用仍然存在争议。需要进一步的研究来验证CRP在AS中的作用，但毫无疑问，hs-CRP是一种临床上有用的生物标志物，可用于心血管疾病的一级和二级预防。

5 总结

急性脑梗死有多个亚型，分别代表不同的形成机制，最多见的应属大动脉粥样硬化型。炎症因子、血管内皮细胞受损及血栓形成均与AS相关，所以探讨与之相关血清生物标志物对AS引起脑梗死的发生、发展及预后至关重要，然而由于一些混杂因素、样本量、单因素及多因素分析等原因，这些生物标志物用于诊断脑梗死的证据尚不充足，仅可供临床参考，需要后来的研究者不断探索更新。也许未来将会找到特异性强、敏感性好的生物标志物来用于脑梗死患者的临床诊断。