玉桂片对黄褐斑模型小鼠皮肤形态及酪氨酸酶的作用研究★

易腾达，万春平，杨登科，叶 飞※

（1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.云南中医药大学第一附属医院，云南 昆明 650021；3.昆明市中医医院，云南 昆明 650011）

黄褐斑属于中医“肝斑”“黧黑斑”“蝴蝶斑”范畴，是一种发生在颜面部的呈蝴蝶状的色素沉着性疾病，局部常为褐色，多见于成年女性[1]，病因及病理机制尚不十分清楚。中医认为，与肝、脾、肾三脏关系非常密切；现代研究普遍认为[2、3]，黄褐斑主要是由于黑色素在皮肤内增多所致，而黑素细胞增多和黑色素生成增多是导致黑色素增多的两个十分重要的因素。

研究表明[4、5]，酪氨酸酶在皮肤黑色素合成过程中起着重要作用，它直接影响黑色素合成的速率，并且是黑素细胞分化以及成熟的特征性标志。西药治疗本病的手段及药物比较有限，其主要目的是减轻面部褐斑的颜色，但大多数外用西药存在一定的副作用及不良反应，且不适宜长期使用[6-8]。然中医药治疗本病手段较丰富，治疗后效果显著且无明显副作用。此外，亦有研究表明[9]，临床上具有美白功效的中药大多通过抑制酪氨酸酶活性而发挥作用。玉桂片为云南省已故名中医皮肤病专家叶之龙的独创良方，该方紧密契合黄褐斑的临床特点及综合考虑云南特殊地理气候因素，组方科学严谨，并且在昆明市中医医院皮肤科应用20 余载，疗效显著。然而玉桂片治疗黄褐斑的疗效机制尚不十分明确，故本研究以此为切入点，进一步探讨其治疗机制。

1 实验材料与方法

1.1 实验动物 48 只清洁级健康雌性小鼠（昆明种），体重20g 左右（上海斯莱克实验动物中心提供）。由实验中心饲养，随机分组，在自然条件同等情况下，常规饲食饮水。室温：20℃～25℃，湿度：20%～30%，维持自然光照，自然摄食、饮水，饲料为全价颗粒饲养（Ca：0.5%）饲养10 天待适应环境后再进行下一步实验。

1.2 实验药品 玉桂片（由中药饮片玉竹、肉桂组成，我院药物制剂科制备），维C 注射液（河南天方药业）。

1.3 实验试剂 酪氨酸酶活性检测试剂盒（北京索莱宝，50T/48S）、BCA 蛋白测定试验盒（北京索莱宝）。

1.4 实验仪器 紫外线光疗仪（深圳冠宏雅，320nm）、电动玻璃习浆机、台式高速冷冻离心机（上海卢湘仪，1 600r/min）、系统生物显微镜，病理图像分析系统、酶标仪、恒温孵育箱（上海合恒）、分光光度计（双鹿，UL-1000）等。

1.5 实验方法

1.5.1 黄褐斑小鼠模型的分组、诱导和给药 48 只昆明种雌性小鼠，随机分为空白对照组、模型对照组、维C 预防组、维C 治疗组、玉桂片预防组和玉桂片治疗组。模型诱导采用中波紫外线照射小鼠以复制黄褐斑实验模型。按分组编号，将小鼠分笼饲养。以剃毛器剃去小鼠背部皮肤短毛，然后将脱毛膏涂于该处，（1 ～2）min 后用干燥布巾擦去，再以湿布擦净。在造模过程中发现小鼠背部短毛长出者，立刻以剃毛器剃尽。并在24h 后进行紫外线灯照射。采用光谱值为320nmUVB 的紫外灯灯管照射，灯管距小鼠背部距离为20cm，持续照射28 天，60min/d。维C 预防组在造模的同时，即进行灌胃给药C 注射液。维C 治疗组在造模28 天后，再灌胃给予维C 注射液28 天。玉桂片预防组在造模同时，即灌胃给予玉桂片。玉桂片治疗组在造模28 天后，再灌胃给予玉桂片。28 天后，空白对照组和模型对照组灌胃等体积的生理盐水。

1.5.2 药物剂型、给药方法和剂量 剂型：维C 注射液：2ml/支；玉桂片：由中药饮片玉竹、肉桂组成，片剂由我院药物制剂科制备；给药方法：以上各组均以灌胃给药；剂量：根据药理实验方法标准换算[10]，玉桂片剂量为0.2ml/只，以纯水将玉桂片剂溶水灌胃，3 次/d；维C 组剂量为0.2ml/只，3 次/d。以上两组给药皆连续28 天。

1.6 取材及观测指标

1.6.1 标本采集 取材之前，除去实验期间死亡（因灌胃致死或自然死亡）的小鼠。于取材之前再行一次脱毛，于小鼠眼眶进行取血，并于最后一次灌药60min 之后将所有小鼠用颈椎脱臼法处死，立即取其脱毛后的背部正中皮肤组织标本（约 1.0cm×1.0cm）。

1.6.2 病理形态学观察 取小鼠背部正中的皮肤组织并制作病理切片，采用HE 染色于显微镜下观察小鼠皮肤形态的病理变化，以了解玉桂片的干预效应。

1.6.3 酪氨酸酶的含量测定 将血液离心15min，取其上清液，按酪氨酸酶试剂盒说明严格操作，进行指标测定。

1.7 统计学方法 采用SPSS 22.0 统计学软件，数据以（±s）表示，组间比较采用t 检验，以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 玉桂片对小鼠皮肤染色的病理形态的影响 HE染色结果显示，空白对照组小鼠皮肤的表皮层、真皮层结构完整，无明显炎症现象。模型对照组小鼠表皮的上皮细胞的增生明显，层数增加时，层的数目增加，出现疣状增生、乳头瘤样增生，局部炎细胞增多，毛和皮脂腺增生明显。维C 预防组皮肤的表层有大量的血液，表皮层缺失，可见部分真皮层、皮下组织。维C 治疗组上皮肤的表皮层较薄、真皮层内可见汗腺和毛囊分布、皮下组织无明显炎症反应。镜下放大可见皮肤的表皮层较薄，有些区域由一层细胞组成，有些区域未见细胞层，真皮层的汗腺和毛囊分布，无明显炎症反应。玉桂片预防组皮肤的表层暗红色物质为血液和坏死组织，表皮层较薄，真皮层可见少量的毛囊和汗腺。镜下放大可见皮肤的皮下组织发生明显瘀血，真皮层和皮下组织有大量炎性细胞浸润，主要为中性粒细胞。玉桂片治疗组皮肤的表皮层较薄、真皮层内可见大量的汗腺和少量毛囊分布、皮下组织无明显炎症反应。镜下放大可见部分皮肤的表层无角质层，表皮层较薄，仅由（1 ～2）层细胞组成，真皮层内可见大量的汗腺和少量的毛囊，无明显炎症反应，结果见图1。

图1 玉桂片对小鼠皮肤染色的病理形态的影响

2.2 各组小鼠血中酪氨酸酶含量 酪氨酸酶检测结果显示，与空白对照组比较，模型对照组小鼠酪氨酸酶含量显著增加，差异有显著意义（P ＜0.05）。与模型组比较，玉桂片预防组、玉桂片治疗组、维C 预防组、维C 治疗组酪氨酸酶含量降低，差异有显著意义（P ＜0.05），见表1。

表1 各组小鼠血酪氨酸酶含量（±s）

表1 各组小鼠血酪氨酸酶含量（±s）

注：与模型对照组比较，*P ＜0.05。

组别 数量 血酪氨酸酶（u）空白对照组 8 1.442±0.674*模型对照组 8 14.414±3.273维C 预防组 8 8.491±0.848*维C 治疗组 7 5.402±0.421*玉桂片预防组 7 4.025±1.007*玉桂片治疗组 6 2.827±0.747*

3 讨论

以黑色素为主沉积于皮肤所致的黄褐斑已逐渐成为影响女性美观的重要原因。普遍认为，其病因与紫外线、某些药物、化妆品、微量元素异常、妊娠、内分泌紊乱、失眠和遗传等因素有关[11-13]。相关调查显示[14]，随着社会的发展，人们生活及工作压力的增加，社会心理因素与黄褐斑的发病存在密切关系。以氢醌为基础的三联疗法被视为黄褐斑的一线治疗，其他治疗方法包括维A 酸、曲酸、乙醇酸和抗坏血酸等药物[15]。但是这些外用药大多只是改变黄褐斑表面的颜色，且疗效有限[16]。

中医认为，黄褐斑的发病主要与肝、脾、肾三脏密切相关，其常见病因是肝气郁结、肾阴不足、肾阳亏虚及脾胃虚弱等。昆明地处云贵高原，空气稀薄干燥，易耗伤人体阴津，易损伤肾阴；昼夜温差大，全年平均气温偏低，致使人体阳气既得不到充分生长，又不能很好收藏，阳气外泄而易出现“阳虚”证。久之，阴损及阳，阳虚之证加剧[17]。肾为先天之本，肾之阴阳亏损，易引发其他脏腑的阴阳亏损。阴津不足，易生虚火，虚火灼伤津液及气血，故发为本病。

本次研究用玉桂片以治疗肝肾不足所致的肝失疏泄，气机不畅，肝郁气滞，气郁化火，灼伤阴血，血瘀成斑；肾气不足，水液代谢失调，肾阴亏虚，虚火上炎，灼络成痰，熏灼头面成斑。方中主要成分有玉竹，肉桂。玉竹为补阴药，养阴润燥，生津止渴；肉桂为温里药，补火助阳，散寒止痛，温经通脉，引火归原。玉竹配肉桂补阳益阴，阳中求阴，补肾阴以养肝阴。玉竹味甘性微寒，肉桂味辛、甘性大热，本方中玉竹与肉桂的用量是3 ∶1，使得本方温补不致燥热。纵观全方具有滋阴润燥，温经散寒，滋养肝肾，温补肝肾，以达到祛斑增白的作用。全方未刻意添加活血祛瘀等药物，更是体现“治病求本”的用药思想。现代药理研究表明[18、19]，玉竹在提高小鼠机体中超氧化物歧化酶的活性，改善小鼠体内抗氧、清除自由基，提高SOD 活力具有显著作用，从而能够降低酪氨酸酶的含量。此外亦有研究显示[20]，玉竹具有延缓衰老，肌肤美白有显著功效。对于黄褐斑等皮肤类疾病皮肤形态发生异常，具有良好的修复作用。

现代医学认为黄褐斑的发病机理极其复杂，与血酪氨酸酶活性增加密切相关。组织学特点主要是表皮中黑色素和黑素小体增加，黑素细胞活性增强，但真正改变黑素细胞功能的原因尚不清楚。而酪氨酸是黑色素合成的原始材料，在黑素小体内酪氨酸酶的作用下经过一系列化学反应合成黑色素[21]。本次研究结果显示，玉桂片在改善小鼠皮肤形态及降低血酪氨酸酶含量具有显著作用，对于改善黄褐斑及预防黄褐斑有显著疗效。然本次研究仅限于动物研究，存在一定的局限性，对于玉桂片治疗黄褐斑的作用机制有待今后进一步深入探讨。