预浸泡-超声法提取胡芦巴中薯蓣皂苷元工艺优化

魏荷琳，毛霞，南泽东，封家福

乐山职业技术学院（乐山 614000）

胡芦巴是豆科一年生草本植物，又名芦巴子、香豆子。在我国，胡芦巴主要产于安徽、河南、四川、新疆、陕西等地，富含有多种有效成分如薯蓣皂苷、有机酸、油脂和色素等，具有很好的滋补和营养功效[1-5]。近年来，虽然就其有效成分的提取分离开展一些研究，然而大部分研究主要集中在提取物的药理作用方面[6-7]。薯蓣皂苷元作为甾体工业的一种原料，主要是从薯蓣科植物中提制而得，通常被用来合成一些甾体激素类药物和避孕药等，同时还具有抑制癌细胞增殖[8]、肝脏保护[9]和抗糖尿病等功效[10-11]。随着葫芦巴种植业和制胶工业发展，人们越来越意识到从制胶后葫芦巴渣中提取薯蓣皂苷元的重要性和必要性。从葫芦巴中提取薯蓣皂苷元，通常采用水回流提取法、有机溶剂提取法和酶解法等[5,12]，这些提取工艺直接影响薯蓣皂苷元的纯度及产品质量[13-14]。

采用预浸泡-超声法提取工艺，考察浸泡时间、液料比、原料目数、超声时间对薯蓣皂苷元提取率的影响，在单因素试验基础上，采用响应面法对提取工艺进行优化，以期为葫芦巴的资源化综合利用和质量控制提供参考依据。

1 仪器与试剂

1.1 主要仪器与设备

1525 EF高效液相色谱仪（美国Waters公司）；501-A型超级恒温水浴（上海浦东荣丰科学仪器有限公司）；101 A-1电热鼓风干燥箱（苏州同福烘箱制造有限公司）；JJ-1定时电动搅拌器（上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司）；RE-52 AA旋转蒸发仪（上海嘉鹏科技公司）；TG 328-A分析天平（沈阳天平仪器有限责任公司）；UT-40超声波发生器（广州兰泰仪器有限公司）；SHZ-CB立式循环水真空泵（上海普渡生化科技有限公司）；TG 16台式高速离心机（北京瑞利分析仪器公司）；JC 517-201/525双波长紫外检测器（北京百万电子科技中心）；WFH-203 B暗箱式三用紫外分析仪（上海精科实业有限公司）。

1.2 主要试剂与药品

脱胶葫芦巴豆粉（脱胶率≥25%，杨凌上禾植物科技有限公司）；醋酸钠（分析纯，天津化学试剂厂）；羧甲基纤维素钠（分析纯，天津化学试剂厂）；薯蓣皂苷元标准品（98%，上海乔羽生物科技有限公司）；纤维素酶（活力单位6万 u/g，日本Yakult）；氢氧化钠、乙醇、石油醚、盐酸、冰乙酸（分析纯，西安试剂厂）；甲醇（液相色谱纯，天津瑞金特化学品公司）；硫酸（分析纯，天津化学试剂厂）。

2 方法与结果

2.1 薯蓣皂苷元含量测定

2.1.1 HPLC色谱条件

Waters C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）色谱柱；流动相：甲醇-水溶液，体积比90∶10；柱温25 ℃；流速1 mL/min；紫外检测波长206 nm；进样量20 μ L。

2.1.2 标准品溶液的制备

准确称取薯蓣皂苷元标准品5.0 mg，用甲醇溶解后放置与5 mL容量瓶中，定容、摇匀即可得1.0 mg/mL的薯蓣皂苷元标准品贮备液。

2.1.3 供试品溶液的制备

准确称取脱脂后的胡芦巴粉末20 g加入700 mL水溶液中预浸泡若干小时，在功率300 W、频率50 kHz的超声波下提取20 min后浓缩，将其酸浓度调节到1.2 mol/L，90 ℃下回流水解5 h，过滤掉酸液，将水解物通过Na2CO3中和水洗至中性，干燥滤饼并加入一定量的石油醚索氏抽提5 h，浓缩提取液称质量并干燥，得到皂苷元样品，准确称取该样品20 g用甲醇溶解，定容摇匀后过滤，即得供试品溶液，备用。

2.1.4 标准曲线的绘制

准确称取薯蓣皂苷元标准品稀释并溶解于流动相，制备薯蓣皂苷元系列标准溶液，其薯蓣皂苷元含量分别为0.10，0.20，0.40，0.60，0.80，0.10和1.2 mg/mL。按照2.1.1色谱条件分别进样20 μL，以薯蓣皂苷元的峰面积为纵坐标Y，标准溶液的浓度为横坐标X，得到线性回归方程：Y=5.573 7×106X-3.221 5×104，R=0.999 9。表明质量浓度在0.10～1.2 mg/mL范围内的线性关系较好。

2.1.5 薯蓣皂苷元提取率的计算

采用外标准法测定，按2.1.1中色谱条件将2.1.3下制备的供试品溶液进样20 μL，用两针重复进样所得数据的平均值计算结果。薯蓣皂苷元提取率可根据式（1）计算。

式中：V为样品溶液体积，mL；M为原料中薯蓣皂苷元的总含量，mg；C1为标准溶液质量浓度，mg/mL；S1为标准溶液峰面积，μV·s；S2为样品溶液峰面积，μV·s。

2.1.6 精密度试验

取2.1.2配制的1.0 mg/mL薯蓣皂苷元标准品溶液，在2.1.1所述色谱条件下进样20 μL，重复进样8次，测定峰面积，求得RSD值为1.03%（n=8），表明仪器精密度良好。

2.1.7 稳定性试验

准确称取薯蓣皂苷元样品10 g，按照2.1.3供试品溶液的制备方法制备样品溶液，分别于0，2，4，6和8 h按2.1.1所述色谱条件进样20 μL，测定峰面积，求得RSD值为1.29%（n=5），表明供试品溶液稳定性良好。

2.1.8 重复性试验

按2.1.3供试品溶液的制备方法制备6份样品溶液，按2.2.1所述色谱条件测定峰面积，求得RSD值为1.56%（n=6），表明该检测方法重复性比较好。

2.2 单因素试验

2.2.1 原料粒度

在浸泡时间4 h、料水比1∶14（g/mL）、超声时间30 min条件下测定原料粒度对薯蓣皂苷元提取率的影响，结果见图1（A）所示。原料粒度较小情况下，薯蓣皂苷元提取率随目数增大而提高，40目以后继续减小粒度，提取率趋于平缓，且有略微下降趋势，这是因为原料粒度太大不利于超声波破壁，从而使得有效成分较难溶出，粒度太小又会使粉碎物料容易凝集，致使滤饼中残留液较多影响过滤效果，从而导致提取率反而下降。因此实际操作过程中应以40～60目为宜。

2.2.2 料液比

在浸泡时间4 h、原料粒度40目、超声时间30 min条件下考察料液比对薯蓣皂苷元提取率的影响。结果如图1（B）所示。料液比1∶14（g/mL）以下时随着料液比提高提取率逐渐增加，且增加幅度较大，再继续增加料液比，提取率虽然有所增加，但增加幅度较相对小了很多，这是因为料液比过小时容器无法有效润湿样品，致使提取率明显较低，料液比过大又会阻碍超声波破碎细胞，导致细胞破碎程度下降，从而影响薯蓣皂苷元的提取率。

2.2.3 浸泡时间

在料液比1∶14（g/mL）、原料粒度40目、超声时间30 min条件下考察浸泡时间对提取率的影响，结果见图1（C）所示。预浸泡时间少于6 h时，随着浸泡时间增加提取率逐渐升高，且在6 h时达到最高值，在6 h以后继续增加浸泡时间，提取率开始呈下降趋势，表明合适的预浸泡时间能有效使溶剂深入到原料细胞内部，有利于薯蓣皂苷元提取，但是浸泡时间过长会使得溶液浓度增大，从而致使提取过程中的传质阻力增加，反而对提取效果不利。因此，预浸泡时间6 h左右为宜。

2.2.4 超声时间

在料液比1∶14（g/mL）、原料粒度40目、浸泡时间4 h条件下考察超声时间对提取率的影响。结果见图1（D），超声提取时间30 min以内，提取率随超声时间增加而增大，继续增加超过30 min以后，提取率开始下降。因此，超声时间30 min为宜。

图1 原料粒度（A）、料液比（B）、浸泡时间（C）和超声时间（D）对提取率的影响

2.3 响应面分析

2.3.1 因素水平的选取

在单因素试验基础上，选择浸泡时间2～10 h、料液比1∶12～1∶18（g/mL）、原料粒度20～100目、超声时间10～50目，根据Box-Benhnken的中心组合试验原理进行设计，-alpha、-1、0、+1、+alpha代表自变量水平设计试验，表1列出自变量的试验水平范围及其编码。

表1 响应面分析因素与水平

2.3.2 响应面分析方案及结果

响应面试验设计方案及结果分析见表2，同时利用Design-Expert 8.0.6软件对试验数据进行方差分析及二次多项式回归拟合，方差分析结果见表3，拟合得到的回归方程：薯蓣皂苷元提取率Y=81.99+2.72A+4.79B+2.34C+3.11D-1.12AB-1.26AC+1.83AD-0.56BC+0.41BD+0.36CD-1.08A2-1.40B2-2.73C2-3.89D2。

从表2的数据可以看出，试验值与预测值很接近，表明该模型的适用性很好。从方差分析表3可知，各因素对薯蓣皂苷元提取率影响程度依次为：B（料液比）＞D（超声时间）＞A（浸泡时间）＞C（原料粒度）。模型p＜0.000 1，失拟差p＞0.05，表明该方程拟合度良好、模型显著、预测性理想、可应用其优化提取工艺。同时，相关系数R=0.988 4，验证实测值与预测值高度相关。

各因素之间交互作用对提取率的影响可通过响应面曲面较为直观地反映。薯蓣皂苷元提取率的响应曲面3D图谱如图2所示。从图2可以看出，料液比与超声时间、超声时间与浸泡时间、料液比与浸泡时间的交互作用均非常显著。运用Design-Expert 8.0.6软件优化所得的预浸泡-超声法提取葫芦巴中薯蓣皂苷元最佳工艺为：浸泡时间6.70 h、料液比1∶15.98 g/mL、原料粒度62.4目、超声时间34.80 min，此时薯蓣皂苷元的提取率为86.89%。

图2 响应面分析图

2.4 模型验证试验

为验证该模型的适用性，在优化出的最优工艺条件下进行3组平行试验，所得薯蓣皂苷元收率分别为87.36%，85.88%和86.73%，平均收率为86.66%，与模型预测值86.89%基本一致，该模型拟合良好，有良好重现性。

3 讨论

通过选取合适参数水平，考察浸泡时间、料液比、原料粒度和超声时间对薯蓣皂苷元提取率的影响，在单因素试验基础上，采用响应面分析法对预浸泡-超声法提取薯蓣皂苷元工艺进行优化，得到最优提取工艺条件为：浸泡时间6.70 h、料液比1∶15.98 g/mL、原料粒度62.4目、超声时间34.80 min。此时薯蓣皂苷元的收率为86.89%，并对模型进行验证，试验证明该模型拟合良好，有良好重现性。研究为从胡芦巴中提取薯蓣皂苷元提供依据。