溶菌酶和乳铁蛋白在冷却牦牛肉涂膜保鲜中的应用

2020-03-03刘琨毅王琪吉莉莉王卫张长贵袁华伟

食品工业 2020年1期

刘琨毅，王琪，吉莉莉，王卫，张长贵，袁华伟 *

1. 宜宾职业技术学院五粮液技术学院（宜宾 644003）；2. 肉类加工四川省重点实验室（成都 610106）；3. 宜宾学院生命科学与食品工程学院（宜宾 644000）；4. 固态发酵资源利用四川省重点实验室（宜宾 644000）

牦牛是中国青藏高原等地的特有畜种，我国大部分地区均有养殖[1-2]。牦牛肉因其独特的口感与优良的营养价值，近年来受到广大消费者的喜爱[3-4]。随着人民生活水平的不断提高，消费者对于肉产品新鲜度的要求也越来越高[5]。目前，市场上有大量冷却肉销售，因其具有鲜肉与冻肉的优良特性，且安全卫生、营养价值保存较为完好，深受消费者青睐，具有成为肉类产品消费主流的趋势[6]。如何安全有效地延长冷却肉的保质期是一个亟待解决的问题，已有方法包括冷冻低温保藏技术、添加天然保鲜剂技术、高压处理技术、辐射保鲜技术等[7-8]。各种保鲜方法各具有优缺点，其中添加天然保鲜剂具有食用安全、保鲜效果好、操作简便等优势，成为冷却肉保鲜技术研究热点[9]。

溶菌酶因其具有可使微生物的细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽的酶类，能导致细胞壁破裂使细菌裂解死亡[10-11]。因此溶菌酶具有一定抗菌保鲜作用，应用于乳制品、蛋制品、水产类制品、肉类等食品的防腐保鲜中[12-15]。但由于革兰氏阴性菌的细胞壁仅内壁层的组成成分为肽聚糖，溶菌酶对革兰氏阴性菌的抗菌作用相对较差[11]。近年来，保鲜剂研发方向倾向于使用2种或2种以上的天然保鲜剂混合形成复合天然保鲜剂，如果能配伍成功，则既能扩大原单一保鲜剂的作用范围，还能降低单一保鲜剂作用量，起到更好保鲜效果[16-19]。乳铁蛋白是一种铁结合蛋白，具有杀菌、抗氧化等多种功能[20-21]。Blake等[22]将乳铁蛋白应用到延长肉类货架期的研究中，取得了不错成效。Farnaud等[23]利用溶菌酶与乳铁蛋白协同抑菌作用的机理，将其应用到猪肉制品中，起到较好抑菌效果。

试验将不同浓度溶菌酶结合乳铁蛋白添加到可食性涂膜液中，对冷却牦牛肉进行涂膜保鲜处理，研究其对冷却牦牛肉的保鲜效果，以期延长冷却牦牛肉货架期。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

溶菌酶（酶活力5 000 U/mg，南宁庞博生物工程有限公司）；乳铁蛋白（武汉鑫伟烨化工有限公司）；牦牛肉（宜宾绿源市场）；可溶性淀粉、海藻酸钠、单甘酯（均为食品级，河南千志商贸有限公司）。

1.2 仪器与设备

PHs-3c型精密pH计（上海理达仪器厂）；BS210S型电子分析天平（北京赛多利斯天平有限公司）；SW-CJ-2FD型超净工作台（苏州净化设备有限公司）；LDZX-30FA型立式高压灭菌锅（上海申安医疗机械厂）；101C-3B型电热恒温鼓风干燥箱（上海市崇明试验仪器厂）；HH-ZK型恒温水浴锅（上海卫凯仪器设备有限公司）；微量滴定管（北京青云卓立精密设备有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 涂膜保鲜剂的制备

准确称取可溶性淀粉30 g、海藻酸钠6 g、单甘酯2 g，在其中加入1 000 mL生理盐水中后加热搅拌均匀，配制成涂膜溶液。在85 ℃水浴中搅拌反应30 min，使用无菌烧杯分装待用[24]。根据试验方案将适量的乳铁蛋白与溶菌酶倒入盛有无菌涂膜液烧杯中快速搅拌使之溶解，调节涂膜保鲜剂溶液的pH待用。

1.3.2 肉样的处理

对从超市购买到的牦牛肉进行冷却排酸，使其中心温度降至0～4 ℃。在无菌操作条件下，去掉筋膜及多余的脂肪，并切成具有较规则形状且质量在25 g左右的肉。

将处理好的肉随机分成若干组，分别浸入相应的涂膜保鲜液中一段时间后，取出沥干1 min，连同空白组（不添加涂膜保鲜液）放入已灭过菌的烧杯中，并用保鲜膜封口后放人0 ℃冰柜中保藏1周。

1.3.3 测定方法及指标

表1 牦牛肉感官评分标准

菌落总数：将保藏1周后的10 g牦牛肉打碎后浸入100 mL蒸馏水中并停留1 min以上，根据ISO 6887-1-2003制备初悬液后制取10倍稀释液[25]。选取合适稀释度的稀释液涂布于PCA平板上，30 ℃恒温培养72 h，进行菌落总数的计数[26-27]。

感官评价：邀请15名具有感官评价经验的专家与实验员组成感官评价小组，在学院食品与营养品评室内完成牦牛肉的感官评价。参照SB/T 10399—2005[28]及韩冬洁等[29]对牦牛肉感官品质的研究方法，从色泽、黏度、组织状态、气味、煮沸后肉汤等5个方面制订牦牛肉的感官评价标准，如表1所示。

1.3.4 天然复合涂膜保鲜剂对牦牛肉减菌化处理的单因素试验

溶菌酶浓度对牦牛肉减菌化处理的影响：控制天然复合涂膜保鲜剂溶液中乳铁蛋白浓度0.35%，并调整天然复合涂膜保鲜剂溶液pH 5.5，考察经过涂膜保鲜剂溶液中溶菌酶浓度分别为0.20%，0.25%，0.30%，0.35%，0.40%，0.45%和0.50%处理20 min冷藏保鲜后牦牛肉的菌落总数及感官评分。

乳铁蛋白浓度对牦牛肉减菌化处理的影响：控制天然复合涂膜保鲜剂溶液中溶菌酶浓度0.35%，并调整天然复合涂膜保鲜剂溶液pH 5.5，考察经过涂膜保鲜剂溶液中乳铁蛋白浓度分别为0.20%，0.25%，0.30%，0.35%，0.40%，0.45%和0.50%处理20 min冷藏保鲜后牦牛肉的菌落总数及感官评分。

天然复合涂膜保鲜剂溶液pH对牦牛肉减菌化处理的影响：控制处理条件为溶菌酶浓度0.35%、乳铁蛋白浓度0.35%、处理时间20 min，分别记录在天然复合涂膜保鲜剂溶液pH 4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5和7.0时利用天然复合涂膜保鲜剂溶液处理牦牛肉冷藏保鲜后的菌落总数及感官评分。

天然复合涂膜保鲜剂溶液处理时间对牦牛肉减菌化处理的影响：控制溶菌酶浓度0.35%、乳铁蛋白浓度0.35%、溶液pH 5.5，分别记录经天然复合涂膜保鲜剂溶液处理5，10，15，20，25，30和35 min冷藏保鲜后牦牛肉的菌落总数及感官评分。

1.3.5 响应面法优化牦牛肉减菌化处理的工艺条件

在单因素试验的基础上，根据响应面法中Box-Benhnken[30]的中心组合试验设计原理，以冷藏保鲜后牦牛肉的菌落总数为指标，进行四因素三水平的响应面分析试验，确定天然复合涂膜保鲜剂溶液对牦牛肉减菌化处理的最佳工艺条件。

1.4 数据分析处理方法

试验数据以x±s表示，采用Origin Pro 10.2软件进行数据制图和统计分析；Design Expert 9.0.3软件进行响应面设计及结果分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 溶菌酶浓度对牦牛肉原料肉减菌化处理的影响

由图1可知，随着溶菌酶浓度的增加牦牛肉的菌落总数随之降低，溶菌酶浓度0.50%时，牦牛肉的菌落总数达到最低，为4.50±0.04 lg（CFU/g）；但溶菌酶浓度0.40%和0.50%时，牦牛肉的菌落总数变化不显著（p＞0.05）。溶菌酶浓度0.20%～0.45%范围变化时，牦牛肉的感官评分随溶菌酶浓度增加而显著增加（p＜0.05），最高可到82.7±0.9分；溶菌酶浓度继续增加至0.50%时，牦牛肉的感官评分反而较0.45%时有所下降，但差异不显著（p＞0.05）。从降低成本方面考虑，选择溶菌酶浓度0.35%～0.45%用于后续响应面法试验。

图1 溶菌酶浓度对菌落总数的影响

2.1.2 乳铁蛋白浓度对牦牛肉减菌化处理的影响

乳铁蛋白浓度的变化对牦牛肉的菌落总数较溶菌酶更为显著，如图1和图2所示。乳铁蛋白浓度逐渐升高时，牦牛肉的菌落总数则表现出逐渐下降趋势，牦牛肉菌落总数在乳铁蛋白浓度为0.50%时达到最低的4.21±0.07 lg（CFU/g），但与乳铁蛋白浓度0.45%时相比，无显著性差异（p＞0.05），如图2所示。乳铁蛋白浓度0.20%～0.40%范围变化时，牦牛肉的感官评分随着乳铁蛋白浓度的升高而增加；乳铁蛋白浓度继续增加，牦牛肉的感官评分有所下降但无显著性差异（p＞0.05）。因此，选择乳铁蛋白浓度0.40%～0.50%用于后续响应面法试验。

图2 乳铁蛋白浓度对菌落总数的影响

2.1.3 天然复合涂膜保鲜剂溶液pH对牦牛肉减菌化处理的影响

由图3可知，天然复合涂膜保鲜剂溶液在pH 4.0～6.0范围内变化时，牦牛肉菌落总数随着pH升高而降低，感官评分则随着pH升高而增加；天然复合涂膜保鲜剂溶液在pH 6.0～7.0范围内时，牦牛肉菌落总数随着pH升高而增加，感官评分则随着pH升高而降低。表明天然复合保鲜剂溶液在pH 6.0时，表现出较强的抑菌能力，经其处理后的牦牛肉菌落总数为4.63±0.08 lg（CFU/g），感官评分达到最高的80.2±0.6分。因此天然复合涂膜保鲜剂溶液减菌化处理牦牛肉的最适pH在pH 6.0左右。

图3 溶液pH对菌落总数的影响

2.1.4 天然复合涂膜保鲜剂处理时间对牦牛肉减菌化处理的影响

由图4可知，天然复合涂膜保鲜剂溶液处理时间在30 min之内变化时，牦牛肉的菌落总数随着天然复合涂膜保鲜剂溶液处理时间的延长而降低，最低可为4.61±0.10 lg（CFU/g）；处理时间延长至35 min时，菌落总数稍有升高，但差异不显著（p＞0.05）。天然复合涂膜保鲜剂溶液处理时间由5 min增加至25 min时，感官评分也随增加；但处理时间继续增加，感官评分则有所下降，主要体现在牦牛肉呈现出一些杂味。因此选择天然复合涂膜保鲜剂溶液处理时间20～30 min用于后续响应面法试验。

图4 处理时间对菌落总数的影响

2.2 响应面法试验

在单因素试验的基础上，以牦牛肉的菌落总数为指标，进行四因素三水平的Box-Benhnken响应面分析试验，其试验方案如表2所示。

表2 响应面试验因素水平

利用Box-Benhnken中心组合试验设计的响应面，对溶菌酶浓度、乳铁蛋白浓度、天然复合涂膜保鲜剂溶液pH、处理时间4个因素分析得到试验结果，如表3所示。

设溶菌酶浓度、乳铁蛋白浓度、溶液pH、处理时间分别为A、B、C、D，以牦牛肉菌落总数为响应值，运用Design-Expert 9.0.3软件对表3中的试验数据进行分析，经多元回归拟合后，得到牦牛肉菌落总数回归方程为：菌落总数=3.93-0.10A-0.19B-0.13C-0.10D+0.095AB+0.15AC+0.31AD-0.003BC-0.24BD-0.017CD+0.18A2+0.28B2+0.33C2+0.22D2。

表3 响应面试验设计及结果

由表4可知，经过方差分析，由不同试验条件下所得到的菌落总数回归方程与响应面值之间的关系模型极显著（p＜0.01），且失拟项检验不显著（p＞0.05），表明未知因素对冷却牦牛肉菌落总数的干扰较小，由此建立的试验模型可以充分拟合试验数据，所得菌落总数的回归方程是能反映菌落总数与减菌化工艺各参数之间关系的数学模型，即可以利用此回归方程确定天然复合涂膜保鲜剂减菌效果的最佳工艺。4个因素对菌落总数影响的强弱顺序依次为：乳铁蛋白浓度＞溶液pH＞溶菌酶浓度＞处理时间。且溶菌酶浓度与处理时间之间、乳铁蛋白浓度与处理时间之间均具有极显著的交互作用（p＜0.01）。

表4 方差分析

根据所得的回归模型及方差分析，得到4个因素两两之间的响应面关系图，见图5所示。基于响应面关系图所反映的各个因素与响应值之间的关系及两因素间交互作用的类型，可以优化冷却牦牛肉试验条件[31-34]。根据响应面图曲面坡度越陡峭两因素交互影响越大的原则[35-39]，由图5可知，因子A（溶菌酶浓度）与因子D（处理时间）之间、因子B（乳铁蛋白浓度）与因子D（处理时间）之间所形成的响应面曲面坡度在6个响应面图中最为陡峭，因此认为因子A与因子D之间、因子B与因子D之间具有很强的交互作用。该结果与表4方差分析所得的溶菌酶浓度与处理时间之间、乳铁蛋白浓度与处理时间之间均具有极显著的交互作用（p＜0.01）的结论相吻合。

通过Design-Expert 8.0.6软件分析确定天然复合涂膜保鲜剂溶液对牦牛肉最佳减菌化工艺为：溶菌酶浓度0.371%、乳铁蛋白浓度0.492%、溶液pH 6.01、处理时间28.68 min。此条件下算出理论值为3.797 lg（CFU/g）。对优化条件进行3组验证试验，得牦牛肉菌落总数为3.77±0.13 lg（CFU/g）。

经测定未使用天然复合涂膜保鲜剂的牦牛肉（对照组）的菌落总数为6.91 lg（CFU/g），使用天然复合涂膜保鲜剂溶液最佳减菌化工艺处理后牦牛肉的菌落总数为3.77 lg（CFU/g），较对照组下降了45.4%，且符合SB/T 10399—2005牦牛肉[28]菌落总数应低于6.00 lg（CFU/g）的相关要求。经最佳减菌化工艺处理并冷却保藏1周后，可获得感官评分为90.8分的牦牛肉。达到在牦牛肉中添加天然复合涂膜保鲜剂抑制冷却过程中微生物的生长且对牦牛肉感官品质的影响不显著的目的[40]。