海带中类胡萝卜素提取工艺条件

毕可海，孙玉奉，张伶俐，聂小伟，张玉清

1. 威海海洋职业学院食品工程系（威海 264300）；2. 山东农业大学食品科学与工程学院（泰安 271018）

类胡萝卜素是一种脂溶性色素，广泛存在于动物、藻类中的天然色素，常被应用于医药和食品行业[1-2]。由于类胡萝卜素含有很长的共轭双键，常吃富含类胡萝卜素的食物能起到延缓衰老、提高免疫力、预防肿瘤等作用[3-4]。而且类胡萝卜素还是人体维生素A的主要来源之一，可以维持正常的视觉功能及促进生长与生殖等[4]。因此，类胡萝卜素是人体内一种必不可少的物质。

海带是一种营养价值丰富的褐藻，是很多加工食品的原材料[5]。海带由于富含碘、矿物质以及能量低而具有很高药用价值。中国是海带生产大国，产量居世界第一[6]，但中国有关的海带加工技术相对比较落后，致使海带加工产品单一，主要集中在海带挂面、海带糕和海带复合调味素等[7-8]，而对海带深加工提取物如海带多酚[9]、类胡萝卜素的研究则不多。

海带富含类胡萝卜素，但由于类胡萝卜素性质不稳定，光照、紫外线照射、高温等都会使类胡萝卜素降解[10]，因此类胡萝卜素的提取并不容易。试验采用有机溶剂浸提法从海带中提取类胡萝卜素，优化类胡萝卜素的提取条件，为从海带中提取类胡萝卜素及其应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

海带（市售，山东荣成）；抗坏血酸（上海源叶生物）；石油醚、丙酮、甲醇、无水乙醇、氯仿等（均为国产分析纯）。

1.2 仪器与设备

紫外可见分光光度计（普析通用）；电子天平（奥豪斯仪器（上海））；TG 16-WS离心机（湖南湘怡实验室仪器）；KQ-500 DE超声（昆山市超声波仪器）。

1.3 海带预处理

用超纯水清洗海带，洗去附着在表层的泥沙等物质。将清洗好的海带在50 ℃下真空干燥，粉碎，保存备用。

1.4 类胡萝卜素的提取

称取海带粉末10 g置于锥形瓶中，加入一定量浸提溶剂，在一定温度下搅拌提取一定时间后，重复提取一定次数，合并提取液，悬蒸浓缩至10 mL，离心，去除杂质，取上清液。于448 nm处的分光光度计中测定吸光度。

1.5 类胡萝卜素含量的测定

类胡萝卜素提取液经紫外-可见分光光度计全波长扫描，在400～500 nm之间选择最大吸收波长448 nm作为类胡萝卜素吸光度的检测波长，计算类胡萝卜素的提取量如式（1）[11]。

式中：A为448 nm下吸光度；V为提取溶剂用量，mL；D为提取液稀释倍数；0.16为消光系数；W为样品干质量，g。

1.6 单因素试验设计

1.6.1 不同溶剂对海带中类胡萝卜素提取量的影响

分别称取海带粉末10 g置于6个500 mL锥形瓶中，每个锥形瓶中分别加入200 mL不同提取溶剂，分别为甲醇、无水乙醇、氯仿、丙酮、石油醚和石油醚-丙酮（1∶1，V/V）的混合溶剂。将锥形瓶在40 ℃条件下水浴加热并搅拌。提取50 min后，抽滤出提取液，滤渣在相同条件下再次提取，合并提取液。

1.6.2 温度对海带中类胡萝卜素提取量的影响

称取10 g经预处理的海带粉末，以200 mL石油醚-丙酮（1∶1，V/V）作为提取溶剂，设定提取温度分别为20，30，40，50和60 ℃，提取时间50 min，提取2次，探讨温度对提取海带中类胡萝卜素含量的影响。

1.6.3 时间对海带中类胡萝卜素提取量的影响

称取10 g经预处理的海带粉末，以200 mL石油醚-丙酮（1∶1，V/V）作为提取溶剂，设定提取时间分别为20，30，40，50，60和70 min，提取温度40 ℃，提取2次，探讨时间对提取海带中类胡萝卜素含量的影响。

1.6.4 料液比对海带中类胡萝卜含量的影响

称取10 g经预处理的海带粉末，以石油醚-丙酮（1∶1，V/V）作为提取溶剂，设定海带粉末与提取溶剂的料液比分别为1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25和1∶30（g/mL），提取温度40 ℃，提取时间50 min，提取2次，探讨料液比对提取海带中类胡萝卜素含量的影响。

1.6.5 提取次数对海带中类胡萝卜素提取量的影响

称取10 g经预处理的海带粉末，置于200 mL石油醚-丙酮（1∶1，V/V）提取溶剂中分别提取1次，2次，3次和4次。提取温度40 ℃，提取时间50 min，探讨提取次数对海带中类胡萝卜素提取量的影响。

1.7 正交试验设计

通过对有机溶剂法对类胡萝卜素提取的单因素试验及结果分析，选取提取温度、提取时间、提取料液比3个因素，进行正交试验，考查各因素条件对类胡萝卜素提取量的影响。

1.8 超声辅助提取对海带中类胡萝卜素提取量的影响

称取10 g经预处理的海带粉末，置于200 mL石油醚-丙酮（1∶1，V/V）提取溶剂中，将提取样品置于35 kHz超声中辅助提取，温度50 ℃，提取一定时间，提取2次，探讨超声辅助对海带中类胡萝卜素提取量的影响。

1.9 抗氧化剂对海带中类胡萝卜素提取量的影响

称取10 g经预处理的海带粉末，置于200 mL石油醚-丙酮（1∶1，V/V）提取溶剂中。加入1%抗坏血酸，温度50 ℃，料液比1∶20（g/mL），提取2次，探讨抗氧化剂对海带中类胡萝卜素提取量的影响。

2 结果与分析

2.1 不同溶剂对海带中类胡萝卜素提取量的影响

类胡萝卜素是一种脂溶性色素，极性较强，根据相似相容原理，类胡萝卜素可能会易溶于极性较强的溶剂中，因此试验选用甲醇、乙醇、氯仿、丙酮、石油醚和石油醚-丙酮（1∶1，V/V）混合溶剂等几种不同溶剂作为提取溶剂。由图1可知，不同提取溶剂对海带中类胡萝卜素的提取率不同。其中类胡萝卜素在石油醚-丙酮（1∶1，V/V）混合溶剂中的提取量明显高于其他几种溶剂，说明石油醚-丙酮混合溶剂更适合类胡萝卜素的提取，这与刘长付等[12]的研究结果一致。因此选用石油醚-丙酮（1∶1，V/V）混合溶剂作为类胡萝卜素提取溶剂。

图1 提取溶剂对类胡萝卜素提取量的影响

2.2 温度对海带中类胡萝卜素提取量的影响

由图2可知，温度对类胡萝卜素提取量影响较大，温度低于40 ℃时，类胡萝卜素提取量随着温度升高而增大；温度在40～50 ℃时，类胡萝卜素提取量受温度影响较小，趋于平缓；但温度高于50 ℃时，类胡萝卜素的提取量明显降低，这可能是因为温度高于50℃，类胡萝卜素结构发生变化，影响类胡萝卜素的稳定性，使得类胡萝卜素的提取量降低[10,13]。因此，试验选用类胡萝卜素的最适提取温度为40 ℃。

图2 提取温度对类胡萝卜素提取量的影响

2.3 时间对海带中类胡萝卜素提取量的影响

由图3可知，在20～50 min范围内，类胡萝卜素提取量随着提取时间延长而升高，提取时间50 min时提取量达到最大，但提取时间超过50 min后，类胡萝卜素提取量开始降低。这可能是由于在提取开始时类胡萝卜素溶出速度大于降解速度，随着时间延长，类胡萝卜素在提取溶剂中基本达到平衡，过长时间提取会对类胡萝卜素起降解作用，使得胡萝卜素提取量下降。与空气中的氧气接触，类胡萝卜素被氧化分解，降低类胡萝卜素提取量。因此，选用类胡萝卜素最适提取时间为50 min。

图3 提取时间对类胡萝卜素提取量的影响

2.4 料液比对海带中类胡萝卜含量的影响

由图4可知，在一定范围内，类胡萝卜素提取量随着料液比增加而增大，料液比为1∶20（g/mL）时，提取量达到最大；继续增大料液比，类胡萝卜素提取量反而有所降低。这可能是因为，初期增大料液比，使得海带与溶剂充分接触，增大提取接触面积，类胡萝卜素提取量增加。因此，试验选用最适料液比为1∶20（g/mL）。

图4 提取料液比对类胡萝卜素提取量的影响

2.5 提取次数对对海带中类胡萝卜提取量的影响

由图5可知，类胡萝卜素提取量随着提取次数增加而增大，但后2次的提取量变化不明显。多次提取会增加溶剂使用量和提取时间。从节约成本和时间的角度考虑，将提取次数定为2次。

图5 提取次数对类胡萝卜提取量的影响

2.6 正交试验分析

由表2可知，温度、时间、料液比对提取类胡萝卜素的影响顺序为：温度＞料液比＞时间。说明提取温度是关键控制因素，对于提取类胡萝卜素的影响最大，影响较小的是料液比，最小的是提取时间。通过试验分析，类胡萝卜素的提取最优条件为：提取温度50 ℃、提取时间50 min、料液比1∶20（g/mL）。

将通过试验分析的A2B2C2与通过正交试验分析的A3B2C2进行试验比较，发现在提取温度40 ℃、提取时间50 min、料液比1∶20（g/mL）时，提取量为0.411 mg/g，而提取温度50 ℃、提取时间50 min、料液比1∶20时，提取量为0.427 mg/g。因此，选取提取温度50 ℃、提取时间50 min、料液比1∶20（g/mL）为最优提取条件。

2.7 超声辅助对海带中类胡萝卜素提取量的影响

类胡萝卜素为细胞内产物，由于细胞壁的存在采用有机溶剂浸提法不能充分使类胡萝卜素溶出，导致提取率下降。近年来超声波提取技术由于提取率高，能有效缩短提取时间等优点备受关注。超声波通过溶剂中小气泡的形成和破碎会破碎细胞组织，从而达到较高提取效率[14]。采用1.8的试验条件进行提取，由图6可知，超声辅助提取可明显缩短提取时间并提高类胡萝卜素提取量，类胡萝卜素提取量在25 min时可达0.476 mg/g，增加了11.48%。这可能是因为超声作用可能会破坏海带的细胞壁从而有助于类胡萝卜素的溶出，从而提高类胡萝卜素提取量。

表1 正交试验设计

表2 正交试验结果分析

图6 超声辅助提取对类胡萝卜素提取量的影响

2.8 抗氧化剂对海带中类胡萝卜素提取量的影响

图7 抗坏血酸对类胡萝卜素提取量的影响

由于类胡萝卜素的性质不稳定，极易被氧化，因此尝试在提取过程中添加抗氧化剂，探讨对类胡萝卜素提取量的影响。由图7可知，抗坏血酸的加入可以明显提高类胡萝卜素提取量，对比于不添加抗坏血酸的提取方法来说，提取量增加15.46%，达0.493 mg/g。这可能是因为类胡萝卜素找中含有的不饱和双键在提取过程中容易被氧化，使得类胡萝卜素提取量降低；添加抗坏血酸可使类胡萝卜素防止被氧化，所以类胡萝卜素可以被充分提取。

3 结论

试验讨论不同提取溶剂、温度、时间、料液比、提取次数、超声辅助及抗氧化剂对类胡萝卜素提取量的影响。通过试验确定提取海带中类胡萝卜素最适条件为：提取溶剂采用石油醚-丙酮（1∶1，V/V）混合溶剂、温度50 ℃、时间50 min、料液比1∶20（g/mL）、提取2次，类胡萝卜素提取量可达0.427 mg/g。通过研究超声辅助提取，发现超声辅助可增大类胡萝卜素的提取量，达0.476 mg/g。通过添加抗坏血酸，可更充分提取出海带中的类胡萝卜素，可达0.493 mg/g。海带是一种较为理想的类胡萝卜素提取原料，通过超声辅助或是加入抗氧化剂提取类胡萝卜素提取效率高、绿色环保、方便快捷。