干制大鲵皮胶原蛋白提取工艺优化

周艳华，张鹏飞，李涛，罗庆华，王建文

1. 长沙环境保护职业技术学院（长沙 410004）；2. 湖南湘典食品有限公司（长沙 410031）；3. 湖南省食品质量监督检验研究院（长沙 410111）；4. 吉首大学大鲵资源保护与综合利用湖南省工程实验室（张家界 427000）；5. 张家界金鲵生物工程股份有限公司（张家界 427000）

随着中国大鲵（学名Andrias davidianus，简称大鲵）的规模化养殖，每年生产商品大鲵约12 000万 kg，其中有大量大鲵皮作为大鲵加工副产物而被丢弃。据报道，大鲵皮中含有丰富的蛋白质，其粗蛋白含量占大鲵皮干质量的96.46%，大鲵皮中胶原蛋白含量换算成干质量达60.66%，约占大鲵皮中蛋白质总量的62.89%[1]。近年来，有少量关于从湿态大鲵皮中提取胶原蛋白的报道。其中，李莉等[2]优化人工养殖大鲵皮中胶原蛋白的提取工艺，结果表明，大鲵皮胶原蛋白提取率可达66.99%。顾赛麒等[1]提取大鲵皮中酸溶性胶原蛋白和酶溶性胶原蛋白，提取率分别为28.88%和66.99%，结果表明，胶原蛋白的三股螺旋结构较为完整。袁通等[3]优化大鲵皮胶原蛋白提取工艺，结果表明，胶原蛋白提取率可达71.94%。李静等[4]以胶原蛋白肽提取率为指标，研究高温高压对提高大鲵皮胶原蛋白肽提取率的影响，结果表明，在优化的条件下其提取率可达80.76%。金文刚等[5]研究从大鲵皮中提取明胶的工艺条件，其中明胶提取率可达13.76%。目前鲜见从干制大鲵皮中提取胶原蛋白的报道。新鲜湿态大鲵皮水分高，在常温下保存易滋生细菌致腐烂变质，需采用低温保存。但低温保存存在耗能高导致成本高等问题。此外，采用新鲜湿态大鲵皮样品加工，存在地域性要求高等问题。若异地加工，需采用冷冻车等工具运输，导致物流成本大大提高。因此，试验以经干燥粉碎后的大鲵皮为试验样品，研究从干制大鲵皮中提取胶原蛋白的最适提取工艺条件。在此基础上，进一步采用紫外光谱扫描、红外光谱扫描分析干制大鲵皮胶原蛋白理化性质，旨在为大鲵皮跨地区加工，节约冷冻、运输等生产加工成本，并为后续大鲵皮胶原蛋白应用研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

大鲵皮（张家界金鲵生物股份有限公司）；羟脯氨酸标准品（美国Sigma公司）；透析袋（上海源叶生物科技有限公司）；胃蛋白酶（1 200 U/g）、乙酸、氢氧化钠、正丁醇等（国药集团化学试剂有限公司）。

1.2 仪器与设备

AR-2140电子分析天平（美国奥豪斯仪器（上海）有限公司）；1-4 LD型冷冻干燥机（德国ALPHA公司）；Avanti J-26 XP冷冻离心机（美国Beckman Coulter公司）；pHS-3 C型精密pH计（上海雷磁仪器厂）；DK-98-11 A恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）；SHA-B水浴恒温振荡器（常州国华电器有限公司）；FYL-C 020 E料理机（九阳股份有限公司）；FW 100万能粉碎机（天津泰斯特仪器有限公司）；NEXUS-470傅立叶红外光谱仪（Nicolet Instrument Corp）；UV 1800紫外可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 干制大鲵皮粉末的制备

将大鲵皮去除皮下脂肪，剪成小块，于50～60 ℃下加热烘至干。将干制大鲵皮置于粉碎机中粉碎，包装待用。

1.3.2 干制大鲵皮胶原蛋白的制备

将干制大鲵皮粉末先采用0.1 mol/L NaOH溶液浸泡24 h以去除非胶原蛋白，其间更换1次碱液，用去离子水洗涤至中性后，用体积分数10%正丁醇溶液浸泡24 h以去除脂肪，其间更换1次溶液，用去离子水洗涤至中性[4]。在此基础上，加入0.5 mol/L乙酸溶液（料液比1∶20 g/mL），于4 ℃下溶胀大鲵皮24 h，组织捣碎，得到大鲵皮匀浆液。加入一定量胃蛋白酶，于4 ℃下酶解。酶解完成后，于100 ℃灭酶10 min，过滤，滤液10 000 r/min冷冻离心10 min得上清液，上清液即为大鲵皮胶原蛋白粗提液。向上清液中加入NaCl盐析，至NaCl浓度0.9 mol/L，过夜，冷冻离心收集沉淀。沉淀溶于0.5 mol/L乙酸，以0.5 mol/L醋酸透析2 d，用纯水透析2 d，透析时每天更换3次透析外液，透析后得到胶原蛋白提取液，冷冻干燥，得大鲵皮胶原蛋白成品，纯化后的胶原蛋白呈白色海绵状。

1.3.3 胃蛋白酶酶解大鲵皮制备胶原蛋白工艺条件单因素试验

1.3.3.1 酶添加量的确定

以3 000，4 000，5 000，6 000和7 000 U/g（以干制大鲵皮质量计，下同）的胃蛋白酶添加量，于pH 2.0下酶解4 h，测定胶原蛋白提取率，确定胃蛋白酶添加量。

1.3.3.2 酶解pH的确定

其他条件不变，按上述确定的酶添加量，分别选择pH 1.5，2.0，2.5，3.0和3.5时酶解，测定胶原蛋白提取率，确定最适pH。

1.3.3.3 酶解时间的确定

其他条件不变，按上述确定的酶添加量、pH，分别选择酶解时间3，4，5，6和7 h时酶解，测定胶原蛋白提取率，确定最适酶解时间。

1.3.4 胃蛋白酶酶解大鲵皮制备胶原蛋白工艺条件正交试验

在单因素试验基础上，以胶原蛋白提取率为指标，对酶添加量、pH和酶解时间3个因素设计L9(33)正交试验，以确定酶解的最佳工艺条件，各因素及水平表如表1所示。

表1 正交试验因素水平表

1.3.5 干制大鲵皮胶原蛋白理化性质的测定

1.3.5.1 干制大鲵皮胶原蛋白紫外光谱扫描

将干制大鲵皮胶原蛋白样品溶于0.5 mol/L乙酸溶液中，配制1 mg/mL的胶原蛋白溶液，采用紫外-可见分光光度计于波长190～400 nm对其进行扫描，记录试验结果。

1.3.5.2 干制大鲵皮胶原蛋白红外光谱扫描

将干制大鲵皮胶原蛋白样品与KBr在玛瑙研钵中混合研磨，手动压片，置于傅里叶红外光谱仪中扫描，扫描范围4 000～400 cm-1，记录试验结果。

1.3.6 大鲵皮中胶原蛋白含量的测定

参照GB/T 9695.23—2008进行羟脯氨酸含量测定。胶原蛋白的质量可由其所含的羟脯氨酸质量乘以其换算系数得到[6]。

式中：1.11为羟脯氨酸换算系数。

2 结果与分析

2.1 酶添加量的确定

酶添加量对干制大鲵皮胶原蛋白提取率的影响如图1所示。干制大鲵皮胶原蛋白提取率随酶添加量增加而逐渐增强，这是由于随着酶添加量增加，酶与底物接触位点增多，反应加剧，提取率提高。但酶添加量大于6 000 U/g时，胶原蛋白提取率增长缓慢，这是由于酶添加量达到一定程度后，胃蛋白酶作用于底物的位点基本反应完全，故胶原蛋白提取率趋于稳定。因此，选用胃蛋白酶添加量6 000 U/g为宜。

图1 酶添加量对干制大鲵皮胶原蛋白提取率的影响

2.2 酶解pH的确定

酶解液pH对干制大鲵皮胶原蛋白提取率的影响如图2所示。随着酶解液pH升高，干制大鲵皮胶原蛋白提取率先升高后下降，酶解液pH 2.0时，胶原蛋白提取率最高。这可能是pH 2.0时，胃蛋白酶活性高，因此胶原蛋白提取率也高。因此，选择酶解液pH 2.0为宜。

图2 pH对干制大鲵皮胶原蛋白提取率的影响

2.3 酶解时间的确定

酶解时间对干制大鲵皮胶原蛋白提取率的影响如图3所示。随着酶解时间增加，干制大鲵皮胶原蛋白提取率不断提高，但时间超过6 h后，其提取率趋于平缓。这是由于随着酶解时间的延长，适用于胃蛋白酶的专一位点已基本反应完毕。因此，选择酶解时间6 h为宜。

图3 酶解时间对干制大鲵皮胶原蛋白提取率的影响

2.4 胃蛋白酶酶解大鲵皮制备胶原蛋白工艺条件正交试验

在单因素基础上，根据正交试验因素水平表，以干制大鲵皮胶原蛋白提取率为指标，对酶添加量、酶解pH和时间3个因素设计L9(33)正交试验，结果如表2所示。

由表2正交试验极差k值分析结果可知，影响干制大鲵皮胶原蛋白提取率的各个因素的主次关系为：pH＞酶解时间＞酶添加量。从k值和经济效益综合考虑，确定最适工艺条件为A2B2C2，即酶添加量6 000 U/g、pH 2.0、酶解时间6 h。验证试验表明，在此工艺条件下，大鲵皮胶原蛋白提取率为86.7%。

表2 正交试验结果

2.5 干制大鲵皮胶原蛋白理化性质的测定结果

2.5.1 干制大鲵皮胶原蛋白紫外光谱扫描

干制大鲵皮胶原蛋白紫外光谱扫描图如图4所示。干制大鲵皮胶原蛋白在230 nm左右处出现特征吸收峰，这是Ⅰ型胶原蛋白的特征紫外吸收峰，这个强吸收峰主要包括电子的n→π*和n→σ*跃迁[7]。试验结果表明提取的干制大鲵皮胶原蛋白为Ⅰ型胶原蛋白。

图4 干制大鲵皮胶原蛋白的紫外光谱图

2.5.2 干制大鲵皮胶原蛋白红外光谱扫描

干制大鲵皮胶原蛋白红外光谱扫描图如图5所示。干制大鲵皮胶原蛋白在酰胺A带（3 287.86 cm-1）、酰胺B带（2 956.93 cm-1）、酰胺Ⅰ（1 600～1 700 cm-1）、酰胺Ⅱ（1 500～1 600 cm-1）、酰胺Ⅲ（1 200～1 400 cm-1）均有特征吸收峰，表明提取的干制大鲵皮胶原蛋白其三股螺旋结构较为完整[1,8]。其中，酰胺A带主要是由N—H伸缩振动和氢键的缔合体引起的，一般在3 300 cm-1左右[9-10]；酰胺B带是由CH2不对称伸缩振动引起。酰胺Ⅰ带是由C＝O伸缩振动引起的，因其对胶原蛋白三股螺旋结构的变化较为敏感，所以与胶原蛋白的二级结构关系密切[11]。酰胺Ⅱ带是由C—N伸缩振动和N—H弯曲振动引起的，本质为α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲叠加形成吸收带，同时Arg，Asp，Glu和Tyr侧链在此区域也有吸收[12]。酰胺Ⅲ带是由N—H变形引起的，可以证明胶原蛋白三股螺旋结构的存在[13]。此外，位于酰胺Ⅱ带和酰胺Ⅲ带之间的一系列吸收峰也表明胶原蛋白三股螺旋结构的完整性[14]。

图5 干制大鲵皮胶原蛋白红外光谱扫描图

3 讨论

从湿态大鲵皮中提取胶原蛋白存在地域性要求高和物流成本高等问题，限制大鲵皮的开发利用。试验提出从干制大鲵皮中提取胶原蛋白，并对其提取工艺条件进行优化。大鲵皮皮质致密、粗厚且韧性较强，往往造成胶原蛋白提取率低下。为提高干制大鲵皮中胶原蛋白的提取率，试验将干制后的大鲵皮粉碎的方式进行预处理，经粉碎后的大鲵皮粉在后续提取中，提高物料与提取溶剂的接触比表面积，因此胶原蛋白提取率得到提高。此外，在后续预处理过程中进一步创新，将除去杂蛋白和脂肪的大鲵皮采用乙酸溶胀，溶胀后的大鲵皮组织结构膨胀、松散，有利于后续胃蛋白酶的作用，使干制大鲵皮的胶原蛋白提取率进一步得到提高。

现有研究主要是从湿态的大鲵皮中提取胶原蛋白，从干制大鲵皮中提取胶原蛋白还鲜见报道。与从湿态大鲵皮中提取胶原蛋白相比较，从提取率来看，试验提取率相对较高，这与提取方法创新密切相关；从提取工艺来看，创新了粉碎、匀浆等工艺，因此增大物料与胃蛋白酶接触的比表面积，所以酶解时间缩短，提取率提高；从提取成本来看，节约湿态大鲵皮冷冻、运输等生产加工成本，实现大鲵皮资源的跨区域加工；从提取得到的胶原蛋白来看，保留了胶原蛋白的三股螺旋结构，具有胶原蛋白生物活性。在后续研究中，可进一步探究大鲵皮胶原蛋白所具有的独特生物活性。

4 结论

胶原蛋白是一种天然高分子蛋白质，具有良好的生物相容性、乳化性、保湿性，被广泛应用于食品、医药和化妆品等领域中。试验首次采用干制大鲵皮为原料，研究干制大鲵皮制备胶原蛋白工艺条件。以胶原蛋白提取率为评价指标，通过单因素试验法，分别研究胃蛋白酶添加量、酶解pH和时间对大鲵皮胶原蛋白提取率的影响。在单因素试验基础上，通过正交试验法进一步优化大鲵皮提取胶原蛋白的工艺，确定最适工艺条件：酶添加量6 000 U/g、pH 2.0、酶解时间6 h。在此工艺条件下，大鲵皮胶原蛋白提取率为86.7%。将干制大鲵皮胶原蛋白进行紫外光谱和红外光谱扫描分析，结果表明，试验中提取的大鲵皮胶原蛋白保留胶原蛋白较为完整的三股螺旋结构，具有生物活性。