血必净通过激活PI3K/Akt/mTOR信号通路减轻大鼠睾丸缺血再灌注损伤*

施 源， 李宏军， 王君君， 李 坚， 邓新超， 鲁 密， 张 辉

(武汉市第八医院， 湖北 武汉 430010)

睾丸扭转是泌尿外科中常见的临床急症之一，常为单侧，主要表现为睾丸连同精索和附睾发生旋转，精索内血流不畅导致睾丸缺血，睾丸内细胞凋亡等，最终易导致患者生殖能力受损或缺失，多发生于幼儿和青少年时期[1-2]。睾丸扭转后出现缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)损伤是睾丸损伤的主要病理生理过程，其可使睾丸生殖细胞凋亡增加，最终导致睾丸萎缩和精子生发功能障碍[3-4]。因此，发生睾丸扭转后尽早进行手术恢复睾丸血供并配合有效的药物保护可减轻其损伤。血必净(Xuebijing，XBJ)注射液是一种中药复方静脉制剂，其具有拮抗内毒素、抗炎症、抗氧化以及改善微循环等多种功能[5-6]。已有研究表明，血必净能减轻I/R损伤[7-8]。但血必净对睾丸扭转引起的I/R损伤的具体作用和相关机制还未见报道。因此，本研究旨在探讨血必净对大鼠睾丸扭转复位I/R损伤的作用和相关机制，为临床治疗睾丸扭转，减轻睾丸I/R损伤提供一定的理论依据。

材 料 和 方 法

1 实验材料与试剂

健康雄性SD大鼠购自湖北省疾控中心(合格证号：No.42000600023890)，体质量(200±20)g。地塞米松(dexamethasone, Dex)购自Sigma；血必净注射液购自天津红日药业股份有限公司；苏木素-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色试剂盒购自碧云天生物技术公司；丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、一氧化氮(nitric oxide，NO)和内皮素1(endothelin-1，ET-1)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；兔抗人p53多克隆抗体、兔抗人cyclin D1单克隆抗体、兔抗人cyclin依赖性激酶2(cyclin-dependent kinase 2, CDK2)单克隆抗体、兔抗人cyclin B1单克隆抗体、兔抗人cleaved caspase-3多克隆抗体、兔抗小鼠Fas多克隆抗体、兔抗人FasL多克隆抗体、兔抗人Bax多克隆抗体、兔抗人Bcl-2多克隆抗体、兔抗大鼠PI3K单克隆抗体、兔抗人p-PI3K多克隆抗体、兔抗人AKT多克隆抗体、兔抗人p-AKT多克隆抗体、兔抗人mTOR多克隆抗体、兔抗人p-mTOR单克隆抗体、兔抗人S6K单克隆抗体和兔抗人p-S6K多克隆抗体均购自Abcam；兔抗人GAPDH多克隆抗体购自Proteintech；HRP标记的山羊抗兔IgG购自Bioswamp；二辛可宁酸(bicinchoninic acid，BCA)法蛋白质定量试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。

2 主要方法

2.1动物模型建立与分组 45只大鼠随机分为5组：对照(control)组、模型(I/R)组、血必净低剂量(XBJ at low dose, XBJ-LD)组、血必净高剂量(XBJ at high dose, XBJ-HD)组和地塞米松(Dex)组，每组9只。所有大鼠适应性饲养1周后进行动物实验，除对照组大鼠外，其它4组大鼠均采用Turner法构建睾丸扭转模型[9]，具体操作如下：采用3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，取大鼠仰卧位，固定四肢及头部，采用常规备皮、乙醇消毒，取左侧阴囊切口约3 cm，逐层切开皮肤、皮下组织及肉膜，从切口挤出左侧睾丸并游离，分离筋膜至附睾，结扎并切断睾丸引带，顺时针扭转睾丸720°，维持1 h后复位并于阴囊壁固定，关闭切口。低剂量和高剂量组大鼠在睾丸扭转手术后分别按照0.5 mL·kg-1·d-1和2 mL·kg-1·d-1的剂量腹腔注射血必净注射液；地塞米松组大鼠术后腹腔注射0.5 mL·kg-1·d-1地塞米松；每日给药1次。对照组采用相同的方式切开阴囊皮肤，不进行睾丸扭转，术后注射相同体积的生理盐水。

2.2标本的采集 分别于给药3、7、14 d后，每组随机处死3只大鼠，取各组大鼠的左侧睾丸组织，将所有睾丸标本沿中轴切开分两部分，分别置于-80 ℃冰箱中保存。

2.3HE染色 将睾丸组织置于10%中性甲醛溶液中固定24 h，常规石蜡包埋后连续切片，设定切片厚度为4 μm，水浴展片和高温烤片后，通过常规脱蜡至水后进行HE染色，最后采用封片处理，光学显微镜后观察各组大鼠睾丸组织的病理组织学变化。

2.4生化检测 将收集的睾丸组织进行匀浆，3 000 r/min离心10 min，收集上清，分别采用硫代巴比妥酸法检测MDA含量，采用羟胺法测定SOD活性，采用硝酸还原酶法检测NO含量，采用放射免疫分析法检测ET-1含量，具体操作依据试剂盒说明书进行。

2.5Western blot实验 将保存于-80 ℃的各组大鼠的睾丸采用RIPA裂解液提取组织蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度，每孔上样30 μL蛋白样品，采用12%的SDS-PAGE进行凝胶电泳分离后，转印至PVDF膜上，使用5%脱脂奶粉进行室温封闭1 h，经TBST洗涤后分别加入一抗，4 ℃孵育过夜；TBST再次洗涤后，加入特异性 II 抗IgG，进行室温孵育1 h，洗膜，ECL化学发光试剂对其曝光显影，拍照保存。每组实验进行3次重复。

3 统计学处理

采用SPSS 22.0软件进行统计学分析，实验数据采用平均数±标准差(mean±SD)表示，多组间比较采用单因素方差分析，均数间两两比较采用SNK-q检验。以P<0.05表示差异具有统计学意义。

结 果

1 血必净减轻I/R大鼠的睾丸损伤

各组大鼠睾丸组织的HE染色结果显示，对照组睾丸曲细精管排列紧密，生殖细胞排列有序，结构层次清晰；I/R模型组睾丸曲细精管排列疏松，生殖细胞排列紊乱，细胞明显减少、脱落；随着作用时间的增加，XBJ低剂量组和高剂量组以及地塞米松组均可见生精细胞排列逐渐恢复正常，细胞层次逐渐清晰明了，少数腔内可见脱落细胞，其中高剂量组病理改善效果较低剂量更为显著,见图1。上述结果表明血必净减轻I/R大鼠睾丸损伤的作用具有时间依赖性和剂量依赖性。

2 血必净改变I/R大鼠睾丸中MDA、SOD、ET-1和NO的水平

生化检测结果显示,与对照组比较，I/R模型组大鼠睾丸组织中的SOD活性显著降低，MDA、ET-1和NO的含量显著增加(P<0.05)；与I/R组比较，血必净低剂量组、高剂量组以及地塞米松组大鼠睾丸组织中的SOD含量明显升高，MDA、ET-1和NO的含量降低(P<0.05),见表1、2。这些结果表明，血必净可升高I/R大鼠睾丸组织中SOD活性，降低MDA、ET-1和NO含量，抑制I/R损伤组织中的氧化应激。

Figure 1. The pathological changes of the rat testis in each group (HE staining, ×200).

图1 各组大鼠睾丸的病理变化观察

表1 各组大鼠不同时点睾丸组织中MDA含量和SOD活性的比较

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsI/R group;&P<0.05vsXBJ-LD group;▲P<0.05vsthe same group at 3 d;■P<0.05vsthe same group at 7 d.

表2 各组大鼠不同时点睾丸组织中ET-1和NO含量的比较

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsI/R group;&P<0.05vsXBJ-LD group;▲P<0.05vsthe same group at 3 d;■P<0.05vsthe same group at 7 d.

3 血必净对I/R损伤睾丸细胞周期相关蛋白的影响

同一时点，与对照组比较，I/R模型组大鼠睾丸组织中CDK2、cyclin B1、cyclin D1和cyclin E的表达水平显著降低，p53的表达水平显著升高；与I/R组比较，血必净低剂量组、高剂量组以及地塞米松组大鼠睾丸组织中CDK2、cyclin B1、cyclin D1和cyclin E的表达水平显著升高，p53的表达水平显著降低，且血必净高剂量组的效果更显著。与第3天相比，血必净低剂量组和高剂量组及地塞米松组第7天和14天大鼠的CDK2、cyclin B1、cyclin D1和cyclin E的表达水平显著升高，p53的表达水平显著降低，且呈时间依赖性(P<0.05),见图2。

Figure 2. The expression of cell cycle-related proteins in the rat testicular tissues of each group detected by Western blot. Mean±SD.n=9.*P<0.05vscontrol group at 3 d;#P<0.05vsI/R group；▲P<0.05vsthe same group at 3 d.

图2 Western blot检测各组大鼠睾丸组织中细胞周期相关蛋白的表达

4 血必净对I/R损伤睾丸凋亡相关蛋白的影响

同一时点，与对照组比较，I/R组大鼠睾丸组织中cleaved caspase-3、Bax、Fas和FasL的蛋白水平显著升高，Bcl-2的表达水平显著降低；与I/R模型组比较，血必净低剂量组和高剂量组以及地塞米松组大鼠睾丸组织中cleaved caspase-3、Bax、Fas和FasL的蛋白水平显著降低，Bcl-2的表达水平显著升高，且血必净高剂量组的效果更显著(P<0.05),见图3。与第3天相比，血必净低剂量组和高剂量组及地塞米松组第7天和14天大鼠的cleaved caspase-3、Bax、Fas和FasL的蛋白水平显著降低，Bcl-2的表达水平显著升高，且呈时间依赖性。这些结果表明，血必净能够降低I/R大鼠睾丸生殖细胞的凋亡水平，其效应呈时间依赖性和剂量依赖性。

5 血必净对I/R大鼠睾丸组织中PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白的影响

同一时点，与对照组比较，I/R模型组大鼠睾丸组织中p-PI3K、p-AKT、p-mTOR和p-S6K的蛋白水平显著降低；与I/R组比较，血必净低剂量组和高剂量组以及地塞米松组大鼠睾丸组织中p-PI3K、p-AKT、p-mTOR和p-S6K的蛋白水平显著升高，且血必净高剂量组的效果更显著。与第3天相比，血必净低剂量组和高剂量组及地塞米松组第7天和14天大鼠的p-PI3K、p-AKT、p-mTOR和p-S6K的蛋白水平显著升高，其效应呈时间依赖性(P<0.05)，见图4。

Figure 3. The protein levels of apoptosis-related molecules in the rat testicular tissues of each group detected by Western blot. Mean±SD.n=9.*P<0.05vscontrol group at 3 d;#P<0.05vsI/R group;▲P<0.05vsthe same group at 3 d.

图3 Western blot检测各组大鼠睾丸组织中凋亡相关蛋白水平的变化

Figure 4. The protien levels of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway-related molecules in the rat testicular tissues of each group detected by Western blot. Mean±SD.n=9.*P<0.05vscontrol group at 3 d;#P<0.05vsI/R group;▲P<0.05vsthe same group at 3 d.

图4 Western blot检测各组大鼠睾丸组织中PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白水平的变化

讨 论

发生睾丸扭转后应及时进行复位手术以恢复睾丸供血，避免患者因睾丸损伤或坏死而影响生育能力[10]。然而临床和基础研究均显示睾丸扭转复位也是一种I/R过程，睾丸缺血恢复供氧后可引起活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)过度生成，同时产生高浓度的活性氮基团，导致细胞凋亡增加，引起睾丸损伤以及生精功能障碍。血必净是在中医中药理论的指导下由多种传统中草药研制而成的，主要包含红花、当归、川穹、丹参以及赤芍等，具有活血化瘀、抗炎、抗氧化、增强免疫力、清热解毒等作用[7-8]，对脓毒症、重度肺炎、全身炎症反应综合征以及I/R损伤等均具有一定的治疗作用[10-13]。本研究构建大鼠睾丸扭转复位模型，结果表明血必净可明显减轻大鼠睾丸扭转复位的I/R损伤，且其作用具有时间依赖性和剂量依赖性。

ROS通过攻击生物膜上的不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化作用而产生MDA，且过量的活性氧可以氧化脂质、细胞膜蛋白和DNA，导致一系列细胞功能障碍或凋亡，进一步加剧缺血性睾丸的组织损伤[14-15]。SOD参与细胞生长分化，其可通过催化超氧自由基发生歧化反应来避免细胞受损，其抗氧化能力可有效减轻睾丸I/R损伤[16-17]。武志刚等[18]的研究表明他达拉非可明显减轻大鼠睾丸扭转复位的I/R损伤，显著升高I/R大鼠睾丸组织的SOD水平，而显著降低MDA水平。ET-1/NO是一对血管活性物质，共同参与调节血管张力。ET是一种强效的缩血管物质，主要由血管内皮细胞合成分泌，广泛分布于神经系统中，生理状态下，低浓度的ET-1可选择性地激动ETB受体，扩张睾丸血管，参与调节睾丸血流。睾丸缺血再灌注后，局部组织高浓度的ET-1使血管发生强烈、长时间的收缩，从而加重局部缺血反应[19]。NO参与调节多种生理病理过程，对各种生殖活动起重要作用，低浓度NO可刺激睾酮分泌，过量的NO可导致生精功能障碍而引起不育[20]。本研究结果表明血必净可升高I/R大鼠睾丸组织中SOD活性，降低MDA、ET-1和NO含量，抑制I/R损伤组织中的氧化应激。

细胞凋亡在维持精子发生的动态平衡中具有重要作用，睾丸扭转复位I/R可促进同侧睾丸细胞凋亡的发生，且凋亡的程度与缺血时间有关[21]。促凋亡因子Bax和抗凋亡因子Bcl-2是一对关系密切的凋亡相关基因，caspase-3是介导细胞凋亡的关键效应分子，其对细胞凋亡的调控具有重要作用[22]。PI3K/Akt/mTOR信号通路参与了细胞增殖、分化、凋亡等生物学过程，并与ROS介导的信号传导密切相关，当细胞出现氧化应激损伤时，可通过激活PI3K/Akt/mTOR信号通路保护细胞[23-25]。研究发现，PI3K/Akt/mTOR通路激活后可抑制肝脏氧化应激反应，从而减缓肝脏IR后的细胞凋亡[26]。PI3K/Akt/mTOR信号通路可调控睾丸组织发育、精原干细胞增殖分化以及精子发生等过程，通过抑制mTORC1通路可诱导未分化精原细胞在生精小管内累积并阻断精原细胞分化[27]。本研究结果表明血必净能够通过介导细胞周期和细胞凋亡相关因子的表达，激活PI3K/Akt/mTOR信号通路来明显减轻睾丸扭转大鼠的I/R损伤睾丸组织的病理损伤，且其作用效果呈剂量依赖性和时间依赖性。

综上所述，本研究表明血必净可有效减轻大鼠睾丸缺血再灌注后睾丸的病理损伤，降低大鼠睾丸组织的氧化应激反应损伤，其作用机制可能与激活PI3K/Akt/mTOR信号通路来实现的，且血必净的作用效果呈剂量依赖性和时间依赖性。本研究结果将为临床应用血必净治疗睾丸扭转，减轻患者的睾丸损伤提供一定的理论依据。