冠心病患者来源HDL对小鼠腹腔巨噬细胞脂质沉积及凋亡的影响*

王 远， 高宏伟， 冯高洁， 代 佩， 张秦风， 白 瑞， 秦卫伟， 李 虹， 高 奋

(山西医科大学第二临床医学院， 山西 太原 030001)

脂蛋白代谢异常是动脉粥样硬化的重要危险因素。低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)水平与冠心病发病呈正相关，而高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL)通过胆固醇逆转运、抗凋亡和抗炎等机制发挥抗动脉粥样硬化作用[1]。然而多个临床研究(ILLUMINATE、dal-OUTCOMES、AIM-HIGH和HPS2-THRIVE)却表明应用胆固醇酯转运蛋白抑制剂虽然可显著升高HDL水平，但心血管事件和死亡风险非但没有下降，反而明显增加[2]，提示单纯升高HDL水平并不能发挥HDL的抗动脉硬化效应。HDL是由载脂蛋白与脂质组成的大颗粒分子，功能上具有高度的异质性。已有研究证实，在糖尿病[3]、代谢综合征、感染[4]、系统性红斑狼疮以及类风湿性关节炎[5]等炎症性疾病时，功能正常的HDL向“失功能HDL”转变，其抗动脉粥样硬化能力下降并具有促动脉硬化作用[6-7]。然而，在冠心病条件下，HDL的功能改变如何，尚缺乏文献报道。本研究将通过提取健康(healthy)人群、稳定型冠心病(stable coronary artery disease, SCAD)和急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI) 3类人群的HDL，体外观察不同人群HDL对巨噬细胞脂质沉积、胆固醇转运蛋白表达及细胞凋亡的影响。

材 料 和 方 法

1 人群资料

选择2018年1月～2018年6月山西医科大学第二医院心内科住院患者200例，其中男性112例，女性88例，年龄48～72岁，根据冠脉造影结果分为冠脉正常对照组65例、稳定型冠心病组68例和急性心肌梗死组67例。记录各组一般资料并进行生化检验，包括性别、年龄、体重、收缩压(systolic blood pressure，SBP)、舒张压(diastolic blood pressure，DBP)、吸烟史、空腹血糖(fasting glucose，FG)、甘油三酯(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein chesterol，LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein chesterol, HDL-C)。所有患者均签署知情同意书，如未取得知情同意，退出本研究。本研究获得山西医科大学第二附属医院伦理委员会的批准，整个实验阶段严格执行医学伦理委员会规章制度。入选患者均排除内分泌疾病、严重肝肾功能异常、严重感染、重度贫血、心脏瓣膜病和肿瘤等疾病。

稳定型冠心病的诊断依据2007版《慢性稳定型心绞痛诊断及治疗指南》，慢性稳定型心绞痛指心绞痛发作的程度、频率、性质及诱发因素在数周内无显著变化的患者，通常见于冠状动脉至少一支主要分支管腔直径狭窄在50%以上，当体力或精神应激时，冠状动脉血流不能满足心肌代谢的需要，导致心肌缺血，而引起的心绞痛发作，休息或含服硝酸甘油可缓解的患者。

急性心肌梗死的诊断依据2012年ESC《第3版心肌梗死全球定义》，AMI的诊断标准为检测到心脏生物标志物心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)上升和(或)下降超过健康人群参考值上限(upper reference limit，URL)第99百分位，且符合下列条件中的至少1项：(1)有缺血症状；(2)新出现或很可能新出现ST段显著抬高或T波改变，或新出现左束支传导阻滞；(3)心电图出现病理性Q波；(4)有新出现的存活心肌损失或新出现局部室壁运动异常的影像学证据；(5)血管造影或尸检发现冠状动脉内血栓。入选患者除满足上述条件外，均满足发病24 h内，行急诊冠状动脉造影检查并证实存在单支或多支血管急性闭塞或伴急性血栓形成。

健康对照组无典型缺血性胸痛，心电图大致正常，经冠状动脉造影证实冠状动脉无斑块及狭窄。

2 实验动物

6～8周龄雄性C57/BL6J小鼠，18～20 g，由山西医科大学实验动物中心提供，许可证号为SXXK (晋) 2015-0001。

3 主要试剂

氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)购自上海昂羽生物技术有限公司；巯基乙酸钠(BD)；抗ATP结合盒转运蛋白A1(ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1)、ATP结合盒转运蛋白G1(ATP-binding cassette transporter G1，ABCG1)、Bax和Bcl-2抗体均购自于Abcam；抗GAPDH抗体(BioWorld);抗β-actin抗体、goat anti-mouse IgG、goat anti-rabbit IgG、RPMI-1640培养基、BCA蛋白浓度测定试剂盒、超敏化学发光试剂和RIPA裂解缓冲液(博士德生物科技有限公司)；0.25%胰蛋白酶、青链霉素混合液和饱和油红O染色液(Solarbio)；活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)测试盒(南京建成生物工程研究所)；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒和细胞凋亡检测试剂盒(Beyotime)；ACK红细胞裂解液(北京诺博莱德科技有限公司)。

4 主要方法

4.1HDL的提取及鉴定 利用溴化钾(KBr)将收集好的新鲜血浆密度调整为1.24×103g/L， 加入含密度为1.063×103g/L的KBr溶液的离心管底部，配平后，65 000 r/min离心320 min。血浆经超速离心后大致分3层：最上层为TG、极低密度脂蛋白(very-low-density lipoprotein, VLDL)和LDL，中间层为HDL，底层为无脂血浆。采用腰穿针将中层HDL吸出后，通过PD-10脱盐柱透析。透析后的HDL冷冻成固态后置入冷冻离心干燥机冻干，约12 h后可形成HDL粉末。HDL粉末溶于去离子水后采用BCA法测定蛋白浓度，本研究中1.5 mL血浆提出的HDL粉末溶于250 μL去离子水后所测的蛋白浓度约为2 g/L。采用SDS-PAGE法鉴定HDL纯度。

4.2小鼠腹腔巨噬细胞的提取、培养及鉴定 将巯基乙酸钠与去离子水配制成2%巯基乙酸钠溶液，121℃灭菌，4 ℃保存备用。8周龄C57/BL6J小鼠予腹腔注射2 mL 2%巯基乙酸钠溶液，刺激72 h。颈椎脱臼处死，乙醇浸泡3 min，剪开皮肤，充分暴露腹膜，腹腔内注射10 mL预冷PBS，轻柔5 min，用注射器抽取腹腔灌洗液至15 mL离心管中，800 r/min离心5 min，弃上清，加入1 mL ACK裂解液裂解3～5 min。离心后20% FBS RPMI-1640培养基重悬细胞，置于37 ℃孵箱内，4 h后PBS冲洗未贴壁细胞，贴壁细胞为纯度较高的原代巨噬细胞。采用F4/80抗体进行标记，荧光显微镜鉴定巨噬细胞纯度。

4.3实验分组及干预 提取的巨噬细胞按每孔1×106个接种于6孔板内，实验分组如下：(1)对照(control)组：无干预措施；(2)ox-LDL组：50 mg/L ox-LDL干预24 h；(3)ox-LDL+HDLhealthy组：50 mg/L ox-LDL及50 mg/L HDLhealthy联合培养24 h；(4)ox-LDL+HDLSCAD组：50 mg/L ox-LDL及50 mg/L HDLSCAD联合培养24 h；(5)ox-LDL+HDLAMI组：50 mg/L ox-LDL及50 mg/L HDLAMI联合培养24 h。

4.4巨噬细胞油红O染色 饱和油红O原液与去离子水按3∶2体积比配制油红O工作液，混匀，室温放置5～10 min，过滤后备用。染色步骤：(1)吸弃各实验组培养液，PBS漂洗3次；(2)4%多聚甲醛固定30 min，蒸馏水浸洗后60%异丙醇浸洗1 min；(3)油红O工作液染色30 min；(4)60%异丙醇漂洗20 s；(5)蒸馏水洗；(6)甘油明胶封片；(7)倒置显微镜观察脂质染色结果，采集图像。

4.5Western blot实验 提取各组细胞总蛋白，以BCA试剂盒测蛋白浓度。取100 μg样品蛋白于沸水1 min变性，取20 μg蛋白样本用SDS-PAGE分离，电泳完毕后半干转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉TBST封闭2 h，分别加入稀释好的 I 抗(抗β-actin、ABCA1、ABCG1、Bax和Bcl-2抗体，均按1∶1 000稀释)，4 ℃摇床低速过夜。TBST充分洗涤后加入相应稀释 II 抗室温轻摇2 h，TBST再次充分洗涤。ECL法显影，分析条带灰度值，以β-actin为参照，用待测蛋白灰度值与内参的比值来表示蛋白表达水平。

4.6巨噬细胞内ROS含量的测定 采用ROS测试盒各组细胞ROS的含量。DCFH-DA原液与PBS按1 ∶1 000配制成工作液。干预结束时，吸弃培养液，用PBS漂洗3次，各取1 mL 工作液加入各实验组，37 ℃，避光孵育1 h，荧光显微镜下观察细胞内ROS的含量，采集图像。

4.7巨噬细胞凋亡率的检测 用annexin V/PI法检测巨噬细胞凋亡率，操作按试剂盒说明进行。

5 统计学处理

采用SPSS 19.0软件进行统计处理及分析，计量数据以均数±标准差(mean±SD)表示。人群资料数据分析前均进行正态性及方差齐性检验，多组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 不同人群临床数据的比较

入选稳定型冠心病患者68例、急性心肌梗死67例及年龄、性别匹配的冠状动脉造影正常者65例。各组间体重指数(body mass index，BMI)、SBP、DBP、FG和TG水平的差异无统计学显著性；与对照组比较，SCAD组及AMI组LDL-C和HDL-C的差异具有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 不同人群临床资料比较

BMI: body mass index; SBP: systolic blood pressure; DBP: diastolic blood pressure; FG: fasting glucose; TG: triglyceride; LDL-C: low-density lipoprotein chesterol; HDL-C: high-density lipoprotein chesterol; SCAD: stable coronary artery disease; AMI: acute myocardium infarction.

2 血浆HDL的分离及鉴定

血浆经超速离心后大致分3层：最上层为TG、VLDL和LDL，中间层为HDL，底层为无脂血浆，见图1A。采用SDS-PAGE鉴定HDL纯度，由于HDL中主要成分为ApoA-I，在30 kD处可见蛋白富集，与血浆样本比较，白蛋白(分子量约72 kD)被大量去除，见图1B。

Figure 1. Isolation and identification of HDL from different subjects. A: different fractions of plasma after sequential ultracentrifugation; B: SDS-PAGE of HDL and plasma. Lane 1: HDL from healthy subjects; Lane 2: HDL from patients with stable coronary artery disease; Lane 3: HDL from patients with acute myocardium infarction.

图1 不同人群HDL的提取及鉴定结果

3 小鼠腹腔来源巨噬细胞鉴定

光镜下巨噬细胞呈圆形、椭圆形、三角形或不规则形，有伪足和突起。荧光显微镜下巨噬细胞特异性标志F4/80呈红色荧光，DAPI染核，可确定巨噬细胞纯度达95%以上，见图2。

Figure 2. Identification of mouse peritoneal macrophages by F4/80 (×40).

图2 小鼠腹腔来源巨噬细胞的鉴定结果

4 油红O染色观察细胞内脂滴含量

与对照组相比，经ox-LDL单独或联合HDL处理后巨噬细胞内脂质沉积明显增加(P<0.05)；与ox-LDL单独处理相比，联合HDLhealthy处理后巨噬细胞内脂质沉积减少，而联合HDLSCAD或HDLAMI处理后巨噬细胞内脂质沉积增加(P<0.05)；与HDLSCAD组相比，HDLAMI组巨噬细胞内脂质沉积进一步增加(P<0.05)，见图3。

Figure 3. Intracellular lipid deposition in mouse peritoneal macrophages. The levels of intracellular lipids were determined by oil red O staining (×200). A: control group； B：ox-LDL group; C: ox-LDL+HDLhealthygroup; D: ox-LDL+HDLSCADgroup; E: ox-LDL+HDLAMIgroup. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsA;#P<0.05vsB;&P<0.05vsD.

图3 用油红O染色法测定小鼠腹腔巨噬细胞内脂质沉积

5 不同来源HDL对泡沫细胞内ROS表达的影响

与对照组相比，经ox-LDL单独或联合HDL处理后巨噬细胞内ROS的含量明显增加；与ox-LDL单独处理相比，联合HDLhealthy处理后巨噬细胞内ROS的生成减少，而联合HDLSCAD或HDLAMI处理后巨噬细胞内ROS的水平反而增加(P<0.05)；与HDLSCAD组相比，HDLAMI组巨噬细胞内ROS的水平进一步增加(P<0.05)，见图4。

6 不同来源HDL对泡沫细胞ABCA1和ABCG1表达的影响

与对照组相比，经ox-LDL单独处理或联合HDL处理后巨噬细胞内ABCA1和ABCG1的表达上调(P<0.05)；与单纯ox-LDL处理组相比，HDLhealthy处理后巨噬细胞内ABCA1和ABCG1的表达进一步增加(P<0.05)，而联合HDLSCAD或HDLAMI处理后巨噬细胞内ABCA1和ABCG1的表达反而下调(P<0.05)；与HDLSCAD组比较，HDLAMI组ABCA1和ABCG1的表达进一步下调(P<0.05)，见图5。

7 不同来源HDL对巨噬细胞凋亡的影响

与对照组相比，ox-LDL处理后巨噬细胞凋亡增加；与ox-LDL处理组比较，HDLhealthy可抑制巨噬细胞细胞凋亡，而HDLSCAD或HDLAMI处理后巨噬细胞凋亡反而增加;与HDLSCAD处理组比较，HDLAMI处理组巨噬细胞凋亡率进一步升高(P<0.05)，见图6。

Figure 4. Intracellular ROS levels were measured by DCF analysis under fluorescence microscope (×200). A: control group; B: ox-LDL group; C: ox-LDL+HDLhealthygroup; D: ox-LDL+HDLSCADgroup; E: ox-LDL+HDLAMIgroup. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsA;#P<0.05vsB;&P<0.05vsD.

图4 荧光DCF法测定巨噬细胞内ROS结果

Figure 5. The protein expression of ABCA1 and ABCG1 in the mouse peritoneal macrophages was determined by Western blot. A: control group; B: ox-LDL group; C: ox-LDL+HDLhealthygroup; D: ox-LDL+HDLSCADgroup; E: ox-LDL+HDLAMIgroup. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsA;#P<0.05vsB;&P<0.05vsD.

图5 Western blot法检测小鼠腹腔巨噬细胞ABCA1和ABCG1蛋白的表达

8 不同来源HDL对巨噬细胞Bcl-2和Bax表达的影响

与对照组相比，ox-LDL处理巨噬细胞后Bcl-2表达下调，Bax表达上调(P<0.05)；与单纯ox-LDL处理组比较，HDLhealthy处理后Bcl-2表达上调，Bax表达下调(P<0.05)，而经HDLSCAD或HDLAMI处理后Bcl-2表达下调，Bax表达上调(P<0.05)；与HDLSCAD处理组比较，HDLAMI处理后Bcl-2表达下调，Bax表达上调(P<0.05)，见图7。

讨 论

脂代谢异常与动脉粥样硬化发病密切相关。LDL尤其是ox-LDL是巨噬细胞泡沫化的重要诱导剂。细胞内脂质过度沉积形成氧化固醇，后者可激活核肝X受体α和β上调ABCA1和ABCG1表达[8]。HDL是胆固醇从细胞内流出必不可少的受体。新生的HDL颗粒在ABCA1的介导下从外周细胞摄取游离胆固醇，进而进一步酯化形成球形HDL颗粒(α-HDL)，α-HDL在ABCG1的介导进一步获取游离胆固醇，将胆固醇从巨噬细胞内移出发挥抗动脉粥样硬化作用[9]。本研究也发现巨噬细胞吞噬ox-LDL后脂质沉积增加，ABCA1和ABCG1表达上调，而来源于健康人群的HDL(HDLhealthy)可进一步上调ABCA1和ABCG1表达，从而减轻泡沫细胞内脂质沉积。

在慢性炎症性疾病如糖尿病、代谢综合征、类风湿关节炎及慢性肾脏疾病时，HDL发生“失功能”改变。“失功能HDL”表现为HDL颗粒成分及结构发生改变[10]。前期我们对337例患者(190例经冠状动脉造影证实为冠心病，127例冠状动脉造影正常)的HDL亚组及ApoA-I含量进行分析，证实冠心病患者HDL成熟障碍，大颗粒HDL比例降低，小颗粒HDL比例增加，大颗粒HDL下降水平与ApoA-I水平呈正相关[11]。蛋白组学分析提示失功能HDL颗粒内ApoA-I含量减少，SAA和MPO含量增加[12]。动物实验也已证明SAA和MPO可抑制胆固醇逆转运诱导脂质沉积增加[13]，这表明，失功能HDL的成分改变可抑制正常的胆固醇逆转运功能。本研究中我们进一步发现与HDLhealthy处理相比，来源于冠心病患者的HDL(HDLCAD)反而导致巨噬细胞内脂质沉积增加，并下调ABCA1和ABCG1表达，提示冠心病患者来源的HDL损害了正常的胆固醇逆转运功能，引起巨噬细胞内脂质沉积，但其分子机制尚不明确。

Figure 6. The apoptotic rate of the macrophages was analyzed by flow cytometry with annexin V/PI staining. A: control group; B: ox-LDL group; C: ox-LDL+HDLhealthygroup; D: ox-LDL+HDLSCADgroup; E: ox-LDL+HDLAMIgroup. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsA;#P<0.05vsB;&P<0.05vsD.

图6 Annexin V/PI法检测巨噬细胞的凋亡

Figure 7. The protein expression of Bcl-2 and Bax in mouse peritoneal macrophages was determined by Western blot. A: control group; B: ox-LDL group; C: ox-LDL+HDLhealthygroup; D:ox-LDL+HDLSCADgroup; E: ox-LDL+HDLAMIgroup. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsA;#P<0.05vsB;&P<0.05vsD.

图7 Western blot法检测小鼠腹腔巨噬细胞Bcl-2和Bax蛋白的表达

HDL的氧化修饰是HDL失功能改变的重要机制。冠心病患者体内氧化修饰高密度脂蛋白(ox-HDL)水平升高，且ox-HDL水平与冠状动脉狭窄程度呈正相关[14]。而HDL经过氧化修饰后其改善内皮功能和抗内皮凋亡能力减弱[15]，具有促动脉粥样硬化效应。HDL经氧化修饰后产生抗原特异性表位，同ox-LDL一样也容易被巨噬细胞吞噬。本研究中我们发现HDLhealthy可抑制泡沫细胞内活性氧生成，而经HDLCAD处理后泡沫细胞内活性氧生成进一步增加，推测与泡沫细胞内脂质沉积密切相关。将HDLCAD尾静脉注射至ApoE-/-小鼠体内，可诱导斑块进展加速，并且HDLCAD可促进内皮细胞凋亡相关蛋白tBid的表达增加[16]。我们的研究也发现HDLhealthy可减轻ox-LDL诱导的巨噬细胞凋亡，提示健康人的HDL具有抗凋亡作用，而经HDLCAD处理后巨噬细胞凋亡比例升高，凋亡相关蛋白Bcl-2和bax表达失衡，提示HDLCAD丧失了正常的抗动脉粥样硬化功能，具有促动脉硬化作用。

本研究中我们首次发现HDLCAD可促进泡沫细胞脂质沉积，并下调ABCA1和ABCG1表达，推测与HDLCAD诱导活性氧生成及促进巨噬细胞凋亡相关。但其详细分子机制仍需进一步探讨，这也为HDL功能恢复研究提供了潜在的治疗靶点。