黄芩苷通过调控TGF-β1/TAK-NF-κB通路对胰腺纤维化的防治作用*

范建伟， 许小凡， 辛嘉萁， 段丽芳， 熊慧敏， 姜盛楠， 杨 娟， 彭青侠， 魏圆圆， 张 红△

(陕西中医药大学 1基础医学院， 2医学科研实验中心， 陕西 咸阳 712046)

慢性胰腺炎(chronic pancreatitis，CP)病因复杂，起始过程各异，持续进展的慢性炎症最终导致胰腺组织结构和功能发生改变，并逐渐被纤维组织所取代，引起不同程度的胰腺内、外分泌功能障碍[1]。胰腺纤维化已被视为各种原因所致CP的共同病理学特征，是慢性胰腺炎病理过程中的核心事件和关键靶标[2-3]。

CP多采用对症治疗，而对于胰腺纤维化缺乏针对性治疗[4]。近年有研究发现中医经方大柴胡汤可以减轻CP患者的临床症状[5]。我们课题组前期研究发现，大柴胡汤可以减轻CP小鼠胰腺纤维化[6]。黄芩苷(baicalin，C21H18O11)是大柴胡汤组方中臣药黄芩的重要成分，有学者研究发现黄芩苷可下调胰腺组织转化生长因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)的表达水平，减少胶原纤维的沉积，对CP大鼠胰腺纤维化具有治疗作用[7]。但是，黄芩苷在抑制TGF-β1后又是如何调控其下游机制进而发挥防治CP胰腺纤维化的作用，目前尚不清楚。

核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)作为重要的转录因子，近年来研究发现其活化程度与胰腺纤维化进展密切相关[8-9]。有学者在大鼠急性肝损伤的研究中发现，黄芩苷可通过抑制NF-κB信号通路活化，进而抑制卵圆细胞的增殖，并诱导已增殖的卵圆细胞向成熟的肝细胞及胆管细胞分化，发挥对肝脏的保护作用[10]。那么，黄芩苷对CP胰腺纤维化进展中NF-κB信号通路是否具有调控作用，其具体调控机制是否与TGF-β1有关，目前尚不明确。本研究通过腹腔注射20% L-精氨酸诱导小鼠CP模型，观察黄芩苷对CP小鼠胰腺组织TGF-β1、磷酸化转化生长因子β活化激酶1(phosphorylated TGF-β-activated kinase 1，p-TAK1)及NF-κB的影响，探讨黄芩苷防治CP胰腺损伤及胰腺纤维化的作用机制，为其临床应用提供可靠依据，并为CP的防治提供新的思路。

材 料 和 方 法

1 药品及试剂

黄芩苷(21967-41-9)购于笛柏生物科技试剂公司；L-精氨酸(A6969-100G)购于Sigma-Aldrich；抗NF-κB p65抗体(SC-8008)和抗转化生长因子βⅠ型受体(transforming growth factor-β receptor type Ⅰ，TGF-βRⅠ)抗体(SC-402)购于Santa Cruz；抗纤维连接蛋白(fibronectin，FN)抗体(bsm-33143M)和抗p-TAK1抗体(bs-5435R)购于博奥森试剂公司；TGF-β1 ELISA检测试剂盒(EK0515)、抗GAPDH抗体(BM1623)、HRP标记的羊抗小鼠(BA1050)及羊抗兔II抗(BA1054)购于博士德试剂公司；RNA提取试剂盒(9767)、反转录试剂(RR036A)及实时荧光定量PCR试剂(RR820A)购于TaKaRa；特超敏ECL化学发光试剂购于碧云天试剂公司；Masson染色试剂盒购于南京建成生物工程研究所；其它试剂由当地生物制剂公司提供的分析纯化学试剂。

2 实验方法

2.1实验动物分组及造模 健康雄性昆明小鼠58只，6～8周龄，体重20～25 g，购于空军军医大学动物实验中心(合格证号0014945)，在(22±2)℃的环境中自由取食饮水，实验前适应性饲养1周。随机分为3组：空白对照(control)组、CP模型(CP)组和黄芩苷治疗(baicalin)组(对照组n=18，每时点6只；CP模型组n=24，每时点8只；黄芩苷治疗组n=16，每时点8只)。CP模型组及黄芩苷治疗组小鼠均给予腹腔注射20% L-精氨酸(每次3 g/kg，每周1次，每次2轮，间隔1 h，持续6周)；空白对照组给予腹腔注射与L-精氨酸等体积的生理盐水。治疗组于造模2周后开始腹腔注射黄芩苷(每次100 mg/kg，每次1次，每周6天，持续4周)；空白对照组及CP模型组分别给予腹腔注射与黄芩苷等体积的生理盐水。

2.2标本的采集与处理 分别在造模后各时间点麻醉处死动物，下腔静脉取血并分离血清，冻存于-20 ℃用于后续ELISA检测。完整摘除胰腺，均匀分配胰腺头、体、尾部，将部分胰腺组织置于10%中性甲醛溶液浸泡固定；另一部分胰腺组织迅速放入液氮中速冻，再转入-80 ℃冰箱保存，用于后续提取蛋白及RNA。

2.3胰腺组织病理学的观察 甲醛固定后的胰腺组织进行脱水、石蜡包埋、3 μm切片，HE及Masson染色观察胰腺组织形态学改变及纤维化程度。

2.4ELISA检测血清TGF-β1浓度的变化 使用ELISA试剂盒检测各组小鼠血清TGF-β1浓度，按照试剂盒提供的标准方法，检测并记录血清样本所测浓度。

2.5免疫组织化学染色观察胰腺组织FN和NF-κB的表达 胰腺组织3 μm切片常规脱蜡至水，枸橼酸缓冲液抗原修复15 min，PBS洗3次，每次5 min,3%过氧化氢室温孵育10 min，5% BSA室温孵育1 h，滴加I抗[抗FN抗体(1∶200)或抗NF-κB p65抗体(1∶150)]于4 ℃过夜，滴加即用型生物素化羊抗小鼠IgG II抗，室温孵育1 h，滴加SABC室温孵育40 min，DAB显色剂显示3 min，苏木素复染、脱水透明及封片。

2.6Western blot检测胰腺组织FN、TGF-βRⅠ、p-TAK1及NF-κB的蛋白水平 取冻存胰腺组织，加入适量蛋白裂解液，充分机械匀浆，冰上孵育30 min，4 ℃离心10 min，提取离心上清液，BCA法蛋白定量，加入loading buffer将样品稀释至4 g/L，上样至SDS-PAGE，电转移至PVDF膜，封闭1 h，滴加I抗分别为GAPDH(1∶1 000)、FN(1∶400)、TGF-βRⅠ(1∶400)、p-TAK1(1∶400)及NF-κB(1∶400)，4 ℃摇床孵育过夜。TBST漂洗3次，每次5 min。HRP标记的II抗(羊抗兔或羊抗小鼠IgG 1∶2 000)，室温孵育1 h。TBST漂洗3次,每次5 min。滴加ECL，在Protein Simple化学发光成像系统中，选取适当时间曝光并拍照。

2.7real-time PCR检测胰腺组织基质金属蛋白酶1(matrix metalloproteinase-1，MMP-1)及金属蛋白酶组织抑制物1(tissue inhibitor of metalloprotease-1，TIMP-1)的mRNA表达 MMP-1/TIMP-1引物序列见表1，按试剂盒操作步骤提取胰腺组织总RNA，逆转录成cDNA。以cDNA为模板进行PCR，反应体系为:SYBR 10 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL,ROX reference dye Ⅱ 0.08 μL,cDNA(20 μg/L)7 μL,ddH2O 1.32 μL。扩增条件为:50 ℃循环预热2 min;95 ℃循环预变性10 min;95 ℃变性5 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共40个循环。以GAPDH作为内参照，采用2-ΔΔCt法定量比较Ct值，计算目的基因的相对表达量。

表1 Real-time PCR引物序列

3 统计学处理

所有实验数据均采用SPSS 13.0统计软件进行处理，计量数据采用均数±标准差(mean±SD)表示，多组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 黄芩苷可以减轻胰腺组织损伤及胰腺纤维化

与空白对照组相比，在造模后2周，CP模型组小鼠胰腺组织出现水肿，炎症细胞浸润，腺泡萎缩及少量坏死，并可见少量胶原纤维的沉积；4周时胰腺损伤持续加重，炎症细胞浸润增多，并出现管状化结构，胶原纤维沉积加重；6周时胰腺小叶结构破坏严重，腺泡进一步萎缩，被大量的管状化结构所取代，甚至出现类似空泡样结构，胰腺纤维化明显，可见大量胶原纤维沉积。黄芩苷治疗组小鼠胰腺损伤程度明显轻于同时点的CP模型组，仅见部分腺泡萎缩及少量炎症细胞浸润，胶原纤维的沉积明显减轻，见图1、2。

胰腺组织纤维化指标FN免疫组化结果显示，空白对照组胰腺组织结构良好，胰腺小叶间无胶原纤维的沉积，CP模型组在造模4和6周时胰腺组织间隙可见明显阳染的胶原纤维，并随造模时间的延长，FN的阳染表达呈上升趋势；而黄芩苷治疗组在4和6周时FN的阳染表达明显低于同时间点的CP模型组，见图3。通过Western blot检测胰腺组织FN的表达显示类似的结果，CP模型组在4和6周时FN的蛋白表达水平明显升高(P<0.01)；而黄芩苷治疗组胰腺组织FN的蛋白表达水平显著低于CP模型组(P<0.01)，见图4。

Figure 1. The pancreatic morphological changes of mice induced by 20% L-arginine (HE staining, ×200). w: weeks.

图1 胰腺组织的病理学改变

Figure 2. The degree of fibrosis in pancreatic tissues (Masson staining, ×200). w: weeks.

图2 胰腺组织的纤维化程度的改变

2 黄芩苷可抑制TGF-β1、TGF-βRⅠ及p-TAK1的表达

通过ELISA检测血清TGF-β1浓度的变化。在造模后2和4周时血清TGF-β1的表达水平明显升高(P<0.01)；而黄芩苷治疗组血清TGF-β1的表达水平明显低于CP模型组(P<0.01),见图5。

通过Western blot检测发现在造模后4周时胰腺组织TGF-βRⅠ及p-TAK1的蛋白水平显著升高(P<0.01)，6周时较前有所下降，但仍较空白对照组高；而黄芩苷治疗组胰腺组织的TGF-βRⅠ及p-TAK1的蛋白水平明显低于CP模型组(P<0.01)，见图6。

3 黄芩苷可以抑制胰腺组织NF-κB的表达

造模后4和6周，在胰腺腺泡细胞、浸润的炎症细胞和胰腺星状细胞(pancreatic stellate cells, PSC)可见大量NF-κB阳性表达,并且NF-κB的蛋白表达量明显高于空白对照组；而黄芩苷治疗组NF-κB的表达水平则显著低于相同时点的模型组(P<0.01)，见图7、8。

4 黄芩苷对MMP-1/TIMP-1平衡的调控作用

与空白组相比，CP模型组小鼠在造模2周时胰腺组织MMP-1 mRNA表达水平开始下降，在4周时降低更为显著(P<0.01)，6周时仍处于较低水平(P<0.01)；而黄芩苷治疗组在造模4和6周时胰腺组织MMP-1的mRNA表达水平较CP模型组明显升高(P<0.01),见图9。

Figure 3. The expression of FN in the pancreas of mice (IHC, ×400). w: weeks.

图3 免疫组化染色观察胰腺组织FN表达的变化

Figure 4. The protein level of FN in the pancreas of mice determined by Western blot. w: weeks. Mean±SD.n=4.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsCP group.

图4 Western blot检测胰腺组织FN蛋白表达的变化

与空白组相比，CP模型组小鼠胰腺组织TIMP-1的mRNA表达水平在造模2和4周时显著升高(P<0.01)，并持续高表达，在6周时TIMP-1 的mRNA表达水平虽有所下降，但仍明显高于空白对照组(P<0.01)；与CP模型组比较，黄芩苷治疗组胰腺组织TIMP-1的mRNA表达水平则相对较低，见图10。

Figure 5. The serum level of TGF-β1 in mice. w: weeks. Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsCP group.

图5 血清TGF-β1含量的变化

讨 论

慢性胰腺炎是临床上常见的消化系统疾病，主要表现为胰腺实质的慢性炎症，胰腺渐进性慢性炎症反应最终导致胰腺纤维化，引起胰腺内、外分泌功能缺陷，严重影响患者的生活质量[11]。因此，深入探讨胰腺纤维化进展中的相关分子机制，有效遏制CP病程进展，是临床上迫切需要解决的难题。

近年来多项临床研究显示，以大柴胡汤为基本组方的中药治疗CP临床疗效确切[4-5]。课题组前期的研究发现[6, 12-13]，大柴胡汤对小鼠CP模型胰腺纤维化具有抑制作用，而黄芩作为复方大柴胡汤的臣药，具有清热解毒之功效。黄芩苷是从黄芩的干燥根中提取的一种黄酮类化合物，具有广泛的药理作用，包括抗炎、抗纤维化及清除氧自由基等作用[14-15]。

Figure 6. The protein levels of TGF-βRⅠ and p-TAK1 in the pancreas of mice. w: weeks. Mean±SD.n=4.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsCP group.

图6 胰腺组织TGF-βRⅠ及p-TAK1蛋白水平的变化

本实验采用腹腔注射20% L-精氨酸成功诱发小鼠CP模型，模拟出CP病程进展中胰腺组织的病理变化。予以腹腔注射黄芩苷干预后发现，黄芩苷治疗组小鼠的胰腺损伤程度明显轻于CP模型组，仅见部分腺泡萎缩及少量炎症细胞浸润，胶原纤维的沉积明显减轻，胰腺组织FN的表达也显著降低，提示黄芩苷可明显减轻CP小鼠胰腺组织损伤程度，减少胶原纤维的沉积，从而发挥抗胰腺纤维化的作用。

研究发现，TGF-β是重要的促纤维化细胞因子，在CP病程进展中，胰腺组织中TGF-β表达上调，可刺激胰腺微环境中胰腺星状细胞活化，促使细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的合成，从而导致胰腺纤维化[16]。我们研究发现，在复制CP模型后小鼠血清的TGF-β1表达水平显著升高，而黄芩苷可降低TGF-β1的表达水平。但是，黄芩苷在降低TGF-β1的产生后是如何调控其下游机制，进而发挥抗胰腺纤维化的作用，目前尚不清楚。

有学者在心肌纤维化的研究中发现，TGF-β1可激活其下游底物TAK1，进而启动相关基因的转录，导致胶原纤维的沉积[17]。亦有研究发现[18-19]，TAK1的过度表达可促进NF-κB信号通路的活化，而NF-κB的活化程度与胰腺纤维化进展密切相关[8-9]。

NF-κB以同源或异源二聚体形式存在，由NF-κB1(p50/p105)、NF-κB2(p52/p100)、RelA/p65、Re1B及c-Rel 5种Rel家族成员组成[20]。有研究发现，RelA/p65是NF-κB最常见的异源二聚体，也是NF-κB信号通路的关键蛋白[21]。在静息状态下，胞质中的NF-κB与其抑制蛋白(inhibitor of NF-κB，IκB)相结合形成三聚体，使其呈非活化状态。当机体在各种损伤因素作用下，IκB激酶(IκB kinase，IKK)诱导IκB发生磷酸化，磷酸化的IκB在泛素介导下被蛋白酶降解，使NF-κB二聚体得以进入细胞核内，从而启动和调控相关基因的转录[22]。

Figure 7. The expression of NF-κB in the pancreas of mice (IHC, ×400). w: weeks.

图7 免疫组化染色观察胰腺组织NF-κB表达的变化

Figure 8. The protein level of NF-κB in the pancreas of mice determined by Western blot. w: weeks. Mean±SD.n=4.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsCP group.

图8 Western blot检测胰腺组织NF-κB蛋白的表达变化

Figure 9. The mRNA expression of MMP-1 in the pancreas of mice. w: weeks. Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsCP group.

图9 胰腺组织MMP-1的mRNA表达变化

Figure 10. The mRNA expression of TIMP-1 in the pancreas of mice. w: weeks. Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsCP group.

图10 胰腺组织TIMP-1的mRNA表达变化

我们在实验中还发现，胰腺组织TGF-βRⅠ及p-TAK1表达水平升高的同时，胰腺组织NF-κB p65的表达水平亦明显升高。因此本研究提示，在胰腺纤维化病程进展中，TGF-β1可能通过与TGF-βRⅠ相结合，促进TAK1的磷酸化，进而激活NF-κB信号通路。而经黄芩苷治疗后，血清TGF-β1表达水平降低的同时，胰腺组织TGF-βRⅠ、p-TAK1及NF-κB的蛋白水平均显著下降，表明黄芩苷可能通过调控TGF-β1/TAK-NF-κB信号通路活性，发挥抗胰腺纤维化的作用。

大量研究证实，胰腺纤维化的发生与ECM的合成增多、降解减少有关[23-24]，而ECM降解受到基质金属蛋白酶和金属蛋白酶组织抑制物的调控[25]。我们在研究中发现，造模后CP模型组胰腺组织MMP-1的mRNA表达水平下降，并维持较低水平，而TIMP-1的mRNA表达水平则显著升高，两者的表达呈现失衡状态，提示在CP病程进展中伴随着MMP-1的表达下调及TIMP-1的过度表达，影响ECM的降解而导致其过度沉积，最终表现为胰腺纤维化的加重。黄芩苷治疗组胰腺组织各时间点MMP-1的mRNA表达水平较CP模型组升高，而TIMP-1的mRNA表达水平较CP模型组有所下降，MMP-1/TIMP-1的失衡状态有所纠正，ECM沉积明显减少。关于MMP-1/TIMP-1失衡的调控机制，目前认识还不够清楚。我们课题组在PSC离体实验中，发现TGF-β1可以明显诱导PSC活化，而采用siRNA干扰NF-κBp65基因后，PSC活化程度及其分泌炎性细胞因子的能力明显降低，同时发现MMP-1/TIMP-1的失衡状态得以改善，提示NF-κB信号通路活化与MMP-1/TIMP-1的失衡有关，抑制NF-κB信号通路可能通过调控MMP-1/TIMP-1平衡，遏制PSC活化，从而发挥抗胰腺纤维化的作用[26]。

综上所述，CP进展中过度生成的TGF-β1可能通过与TGF-βRⅠ结合，引发TAK-NF-κB信号通路活化，进而导致胰腺纤维化。黄芩苷可以抑制TGF-β1生成，使TGF-β1/TAK-NF-κB信号通路的活化程度减低，进而调控MMP-1/TIMP-1的平衡，减少ECM沉积，抑制胰腺纤维化的进展，通过多靶点干预胰腺纤维化，有效遏制了CP病程进展。