利用CRISPR/Cpf1系统构建稳定敲除LncRNA458314的肾癌细胞株及其功能探讨

周洋，陈兵海，王诚悦

(江苏大学附属医院泌尿外科，江苏 镇江 212001)

肾癌又称肾细胞癌，在人类泌尿系肿瘤中占第二位，外科手术根治是最主要的治疗手段，然而肾癌发生发展的分子生物学机制仍然未得到阐明[1]。越来越多的长链非编码RNA(LncRNA)被证实参与了细胞内多种重要的调控过程。LncRNA在肾癌细胞中的生物基础研究进展能够提高肾癌的预测、诊断和个体化治疗能力[2]。

基因编辑技术发展迅猛，目前已经由第1代“锌指核酸内切酶(ZFN)”和第2代“类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)”发展到第3代“基因组定点编辑技术”[3]。与前两代基因编辑技术相比，第3代基因编辑技术具有操作简便，快捷高效，耗费成本低等优点[4-5]。正是有了这些优势，第3代基因编辑技术迅速成为科研和医疗等领域的有效工具。CRISPR/Cpf1是第3代“基因组定点编辑技术”的最新代表。本课题组在前期研究中发现，通过分析和对比微阵列数据集可以找到肿瘤中差异表达的基因[6]。本研究通过分析和对比微阵列数据集GSE61763中的样本实验数据发现LncRNA458314在肾透明细胞癌组织样本中的表达与在非病理性肾组织样本中的表达相比有明显差异，信噪比为0.88。因此，本研究通过新基因编辑系统CRISPR/Cpf1来编辑肾癌细胞中的LncRNA458314，以探讨LncRNA458314在肾癌发生发展中的作用。

1 材料与方法

1.1 主要材料

肾癌细胞株769P来源于美国模式培养物集存库细胞公司，在含有10%胎牛血清的1640培养基，5%CO2、37℃恒温箱中培养。293T细胞株购自汉恒生物科技(上海)有限公司，在含有10%胎牛血清的DMEM培养基，5%CO2、37℃恒温箱中培养。RNA提取试剂盒购买自上海超研生物科技有限公司，反转录试剂盒及荧光定量PCR试剂盒购买自南京诺维赞生物科技有限公司。蛋白质印迹实验使用的一抗pAKT、pERK、LC3A/B、GAPDH及二抗均购自美国CST公司。

1.2 方法

1.2.1 克隆靶向LncRNA458314 CRISPR/Cpf1质粒 共分为5个步骤：① 设计两个gRNA序列,gRNA1的序列为 5′-ACACTGGAAGCCCCTGAGAGAGA-3′，gRNA2的序列为5′-CAGATTCGTGTCTATGTTCTTCT-3′; ② BSMBI内切酶切开PY108质粒并提纯; ③ 将克隆的gRNA序列克隆连接于PY108质粒中; ④ 转化; ⑤ 目的质粒测序验证。

1.2.2 制作慢病毒 REV、GAG和VSVG质粒的制备：3支摇菌管中分别加入5 μL上述3种菌液和5 mL氨苄西林抗性培养基，然后置于37℃摇床12 h。按小抽试剂盒说明书抽提3种质粒后，放于-20℃备用。

病毒液制备：三无(无血清、无双抗、无谷氨酰胺)DMEM培养基饥饿293T细胞2 h后换成普通DMEM培养基，然后配置A和B液(A液为200 μL三无培养基加1.5 μg目的质粒和包装系统混合液3 μg；B液为200 μL三无培养基加4 μL lip2000并于室温放置5 min)。将上述A、B液混匀后，室温放置20 min后加入293T细胞中。第3天将原培养基换为含有2%血清的DMEM培养基。第5天收集病毒液(3 000 r/min离心10 min，去除沉淀，取上清液)，置于-80℃保存。

1.2.3 病毒感染769 P细胞 第1天种适当密度的769P细胞至6孔板；第2天加入病毒液；第3天补加1 mL培养基，保留原病毒液；第4天消化细胞，取5、10、20、50和100 μL细胞悬液分别加入大板中进行培养；第5天加入浓度为1 μg/ μL的嘌呤霉素10 μL进行筛选，大约1～2周后有单克隆出现。挑选17个单克隆分别置于6孔板培养，等待满板后用于荧光定量PCR检测。

1.2.4 实时定量PCR检测LncRNA458314的表达 将培养的所有单克隆细胞用RNA提取试剂盒提取出RNA后，使用分光光度仪检测RNA的浓度及纯度，再使用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，反转录反应条件为37℃ 15 min，85℃ 5 s。最后按照RT-PCR试剂盒说明书检测对照组769P细胞和实验组单克隆细胞中LncRNA458314 的相对表达量，反应条件：预变性95 ℃ 5 min；40个循环反应95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s；溶解曲线95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。

1.2.5 CCK8实验检测LncRNA458314敲除后769P细胞的增殖能力 准备对照组和实验组细胞，通过细胞计数将96孔板的每个单孔细胞固定为1万个，并设置0、24、48和72 h四个时间点。按照CCK-8试剂盒说明书的实验步骤进行操作，分别测得对照组及单克隆组各时间点的光密度(D)值用于分析和作图。

1.2.6 蛋白质印迹检测LncRNA458314敲除后769P细胞pAKT、pERK、LC3A/B蛋白的表达 收集细胞后，加入裂解液裂解细胞30 min，提取蛋白后根据标准曲线检测蛋白浓度，蛋白变性后上样予SDS-PAGE凝胶电泳，用PVDF膜转膜后，以3%BSA封闭1 h，以兔抗人一抗pAKT、pERK、LC3A/B和GAPDH(1 ∶1 000)4℃ 孵育过夜，羊抗兔二抗(1 ∶5 000)室温孵育2 h，使用化学发光成像系统曝光。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 克隆靶向LncRNA458314 CRISPR/Cpf1质粒结果

使用酶切、连接克隆靶向LncRNA458314 CRISPR/Cpf1质粒后进行电泳。靶向LncRNA458314 CRISPR/Cpf1质粒大小为12.8 kb，见图1。提取目的质粒进行测序，测序结果显示LncRNA458314 CRISPR/Cpf1质粒构建成功，见图2。

图1 LncRNA458314 CRISPR/Cpf1质粒电泳图

图2 LncRNA458314 CRISPR/Cpf1质粒测序结果

2.2 敲除单克隆中LnRNA458314的表达

实时定量PCR结果显示，17个单克隆细胞中的LncRNA458314表达量较对照组细胞均有下调，见图3。

C：对照组；1-17：1号-17号敲除单克隆

通过多次实时定量PCR检测对比后，挑选了6号(6#)、13号(13#)单克隆进行后续实验。同时再次对6#、13#单克隆进行实时定量PCR检测，证实6#、13#单克隆中的LncRNA458314表达量较对照组显著下降(6#：t=-32.237，P<0.01；13#：t=-26.653，P<0.01)。见图4。

*：P<0.01，与对照组比较

2.3 LncRNA458314敲除单克隆的增殖能力

CCK8实验结果显示，LncRNA458314下调后，单克隆6#和13#在72 h时间点的增殖能力较对照组明显下降(6#：t=-3.798，P<0.05；13#：t=-6.411，P<0.01)。见图5。

*：P<0.05，#:P<0.01,与对照组比较

2.4 LncRNA458314敲除单克隆pAKT、pERK和LC3A/B的表达

蛋白质印迹结果显示，6#和13#单克隆pAKT的表达水平显著下降(6#：t=-63.827，P<0.01；13#：t=-113.332，P<0.01)；pERK的表达水平明显下降(6#：t=-28.545，P<0.01；13#：t=-111.135，P<0.01)；LC3A/B的表达显著上升(6#：t=24.417，P<0.01；13#：t=43.140，P<0.01)。见图6。

3 讨论

肾癌是一种多基因相关的肿瘤,通过研究肾癌相关LncRNA可以加深人们对于肾癌发病机制的理解，同时也有利于肾癌的诊断和治疗[7]。新基因编辑系统CRISPR/Cpf1中的Cpf1是Cas9的替代者，与Cas9相比，Cpf1有其独特的优势[8]。第一，Cpf1的分子量比 Cas9 小且只需要一个RNA分子辅助即可[9-10]；第二，Cpf1识别的PAM序列具有特征性，能更好地进行基因编辑[11]；第三，Cpf1切割DNA形成黏性末端，相比于Cas9 切割 DNA 形成的平末端，能更好地使目的基因插入[12]。目前CRISPR 基因编辑技术的缺点是可能存在脱靶效应[13]。脱靶效应的产生原因就是CRISPR/Cpf1在基因编辑中达到编辑目的后不能及时终止，从而导致在不必要的位点随意剪切[14]。对CRISPR/Cpf1 基因编辑来说，精确调控 Cpf1在什么时间、什么位置进行基因编辑是十分重要的[15]。目前已有研究发现抗 CRISPR 蛋白可以有效地降低脱靶效应，其中的一种名叫“AcrllA4”的蛋白能将脱靶效应发生率减少 4 倍左右[16]。我们通过新基因编辑系统CRISPR/Cpf1成功敲除了肾癌细胞中的LncRNA458314，并通过初步研究发现肾癌的发生与发展可能与LncRNA458314相关，对该LncRNA的进一步分析有利于揭示肾癌的发病机制，从而可能为肾癌的早期筛查提供新的分子标志物。

*：P<0.01，与对照组比较

本研究结果表明LncRNA458314敲除后单克隆6#和13#的增殖能力明显下降。蛋白质印迹结果显示，下调肾癌769P细胞中LncRNA458314的表达后，pAKT和pERK的表达水平下降，LC3A/B的表达上升。AKT在调控细胞增殖和凋亡的过程中起到至关重要的作用。研究表明AKT通过磷酸化和灭活多个靶标来抑制凋亡从而促进了细胞的增殖[17]。LncRNA458314敲除后单克隆6#和13#的pAKT表达下降，我们推测LncRNA458314通过激活pAKT来促进肾癌细胞的增殖。pERK信号通路与癌症诊断和治疗密切相关并且可以响应多种细胞内刺激，例如促分裂原、激活生长因子和细胞因子等[18]。pERK的表达在LncRNA458314敲除后单克隆6#和13#中降低，推测LncRNA458314可能激活了pERK的表达，从而促进了肾癌的发生发展。研究表明LC3A/B表达的高低与细胞自噬的能力有着一定的关系[19]。LC3A/B表达量在LncRNA458314敲除后单克隆6#和13#中表达明显增加，我们推测LncRNA458314通过抑制LC3A/B的表达进而抑制了细胞自噬。

综上所述，本研究应用新基因编辑系统CRISPR/Cpf1成功敲除了肾癌细胞769P中的LncRNA458314。实验初步证实LncRNA458314可能是促进肾癌细胞增殖的重要基因，LncRNA458314可能通过调控pAKT、pERK和LC3A/B发挥其生物学作用。