发酵香肠中分离纯化的三株乳酸菌产酸特性研究

吉莉莉，魏艳，何丹，陈雪玲，付婷婷，张崟，赵黎明

(1.成都大学肉类加工四川省重点实验室，成都 610106；2.华东理工大学 发酵工业 分离提取技术研发中心，生物反应器工程重点实验室，上海 200237)

聚乳酸(PLA)是以微生物发酵产物L-乳酸为单体聚合成的一类聚合物，有独特的生物降解和生物相容性，在生物体内可被水解成乳酸和乙酸，并经机体内酶代谢为二氧化碳和水[1-3]，代谢产物不会造成环境污染。近年来，聚乳酸材料在食品包装材料、药物、生物医学等方面应用广泛[4-6]。天然的乳酸菌所产生的乳酸具有合成聚乳酸的潜力，更加保证了原料的天然性、安全性和环保性。

乳酸菌是发酵肉制品中的优势菌群，其主要作用是将肉制品中的糖类通过发酵转化为乳酸，进而使发酵肉制品的pH下降，起到抑制腐败菌生长的作用[7-9]。鉴于乳酸菌为发酵香肠的优势菌种，我们从发酵香肠中分离鉴定出了3株乳酸菌。为了进一步分析所得乳酸菌的产酸能力，本文对其产酸性能及生长特性进行了研究。以期为工业化发酵制备乳酸，并将其用于聚乳酸类可降解材料的制备提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种

试验所用3株菌株均分离于实验室四川传统发酵香肠，分别为1号粪肠球菌(SIIA9047，Enterococcusfaecalis)、3号戊糖片球菌(SIIA9048，Pediococcuspentosaceus)和4号肠膜明串珠菌(SIIA9049，Leuconostocmesenteroides)。

1.1.2 培养基及试剂

L-乳酸标准品：Sigma-Aldrich公司；MRS液体培养基：杭州微生物试剂有限公司；氯化钠、磷酸、氢氧化钠：成都市科隆化学品有限公司；pH标准缓冲溶液：上海仪电科学仪器股份有限公司。

1.1.3 主要试验仪器与设备

UV-1100紫外可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公司；恒温培养箱 上海一恒科学仪器有限公司；PHS-3C-01酸度计 上海三信仪表厂；YX-1 SHDD手提式高压灭菌锅 江阴滨江医疗设备有限公司；WPS-3000SL高效液相色谱仪 赛默飞世尔科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 生长曲线的绘制

将待测菌株以5.0 log CFU/mL分别接种于500 mL MRS培养基中，调整浓度至5.0 log CFU/mL，置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h，以 MRS 液体培养基为空白对照，每隔1 h在600 nm下测定菌液的OD值，绘制生长曲线。

1.2.2 产酸能力的测定

将待测菌株以5.0 log CFU/mL分别接种于250 mL MRS培养基中，置于37 ℃恒温培养箱中培养，无菌取5 mL菌液，用酸度计测定菌液pH值，测10 d。

1.2.3 乳酸含量的测定

色谱分析条件：C18色谱柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)，柱温：35 ℃；检测波长：210 nm；进样量：20 μL；流速：0.8 mL/min；流动相：乙腈∶pH 2.0 磷酸溶液为2∶98(体积比)，配好后抽滤超声脱气待用[10]。

样品处理：取培养0，12，24，48 h的菌液2 mL，置于100 mL容量瓶中，加入70 mL水，在50 ℃的水浴中超声20 min，冷却至室温，用水定容至刻度，摇匀，用0.45 μm滤膜过滤，滤液装入液相样品瓶中待测。

标准曲线的绘制：精密称取L-乳酸标准品，配制成8，2，0.5，0.125，0.0313，0.0078 g/L浓度的溶液，在高效液相色谱仪中进行含量测定，并以峰面积-含量绘制标准曲线。根据标准曲线计算培养基中乳酸含量。

1.2.4 耐盐、耐亚硝酸盐性能测定

将待测菌种以5.0 log CFU/mL分别接种于质量浓度为0，2，4，6 g/dL NaCl及质量浓度为0，5，10，15 mg/dL NaNO2的MRS培养基中，每种培养基250 mL，置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h，在600 nm下测定菌液OD值的变化。利用OD-乳酸菌数量标准曲线计算出菌液浓度。

1.2.5 不同温度下菌株的生长能力测定

将待测菌种以5.0 log CFU/mL分别接种于250 mL MRS培养基中，置于4，10，20，30，40 ℃条件下恒温培养24 h，在600 nm下测定菌液OD值的变化。利用OD-乳酸菌数量标准曲线计算出菌液浓度。

1.2.6 不同pH值下菌株的生长能力测定

将待测菌种以5.0 log CFU/mL分别接种于250 mL pH 2.5，4.5，5.5，6.5的MRS培养基中，置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h，在600 nm下测定菌液OD值的变化。利用OD-乳酸菌数量标准曲线计算出菌液浓度。

1.2.7 数据处理

每个组设置3个重复组，所测得的数据经过IBM SPSS Statistics 24分析，并以平均值±相对偏差表示。

2 结果与讨论

2.1 菌株生长曲线的绘制

经过0～24 h，每隔1 h对3株菌株的OD值进行测定，绘制出3株菌的生长曲线，见图1。

图1 菌株生长曲线Fig.1 Growth curves of strains

由图1可知，3号和4号菌的生长曲线呈现较强的生长能力，1号菌处于3株菌的最低水平，在8 h后3号和4号菌的生长速度显著高于1号菌，3号和4号菌在18 h后趋于缓慢生长，生长曲线较平缓，1号菌从17 h后生长速度减缓，菌的OD值变化不大。由此可见，迟缓期1号菌为0～5 h，3号菌为0～2 h，4号菌为0～3 h；对数期1号菌为6～17 h，3号菌为3～18 h，4号菌为4～18 h；稳定期1号菌为17 h后，3号菌为18 h后，4号菌也为18 h后，由于监测时间有限，未检测到乳酸菌的衰亡期。这与文献[11]所检测的青贮饲料中乳酸菌有所差异，可能是由于菌种不同所引起的。

2.2 菌株的产酸能力比较

图2 菌株产乳酸量Fig.2 Quantity of lactic acid produced by lactic acid bacteria

图3 菌株的产酸曲线Fig.3 Acid production curves of lactic acid bacteria

由图2和图3可知，3株菌在培养初期 pH值的下降速度最为迅速，随着时间的延长，趋势逐渐变缓，到最后几乎没变化。3株菌在12 h内产酸能力最强，在48 h内1号菌产乳酸量持续增加，3号、4号菌则有所下降。结合3株菌的生长曲线，1号菌生长速度最慢，但产乳酸量最多，且第2天pH已经降到4.0以下，产酸能力最强；3号和4号菌产酸能力则弱于1号菌。Garriga认为，在发酵肉制品中，产酸能力是筛选乳酸菌的一个重要指标，发酵所产的乳酸使产品的pH下降，抑制腐败菌的生长，提高产品安全[12]。乳酸菌产生的酸还能够赋予发酵肉制品特征性的酸味[13]。而且，用于发酵肉制品的乳酸菌，为了抑制病原菌，保证产品质量，要求在24 h内能使pH降到5.0以下[14]。在发酵肉制品中筛选乳酸产量高的乳酸菌，可以为聚乳酸提供更加安全的食品级原料，保证乳酸原料的安全与环保性。

2.3 菌株对NaCl的耐受性

菌株对不同质量浓度NaCl的耐受性见表1。

表1 菌株对不同质量浓度NaCl的耐受性Table 1 Tolerance of strains to different concentration of NaCl

注：表中数值为菌株在相应培养基中培养24 h所得发酵液中菌液浓度(log CFU/mL)。

由表1可知，随着培养基中NaCl质量分数的增加，3株菌的生长受到了不同程度的抑制，虽然还能继续生长，但是盐浓度越高，生长情况越差，说明这3株菌的生长受盐含量的影响较大。当NaCl质量浓度增加到6 mg/dL时，3株菌的菌液浓度分别降低了43.14%、27.58%、38.32%，3号菌受到的影响最小，耐盐性最好，4号次之。

2.4 菌株对NaNO2的耐受性

肉制品中常用NaNO2作防腐剂、发色剂。因此，肉制品发酵所用的菌株对NaNO2有一定的耐受性[15，16]。菌株对不同质量浓度NaNO2的耐受性见表2。

表2 菌株对不同质量浓度NaNO2的耐受性Table 2 Tolerance of strains to different concentration of NaNO2

注：表中数值为菌株在相应培养基中培养24 h所得发酵液中菌液浓度(log CFU/mL)。

由表2可知，3株菌均符合要求，随着培养基中NaNO2添加量的增大，3株菌均受到了不同程度的影响。在NaNO2质量浓度达到15 mg/dL时，3号和4号菌的生长情况较好，所受影响很小，对NaNO2的耐受性好，1号菌受到的影响最大，生长受到抑制，但也能生长，对NaNO2的耐受性较好。

2.5 菌株在不同温度条件下的生长能力

菌株在不同温度条件下的生长能力见图4。

图4 分离菌株在不同温度下的生长能力Fig.4 Growth ability of isolated strains at different temperatures

发酵肉制品的发酵剂一般要求能在15～40 ℃条件下生长，低温下也能有较强的生长能力，最适生长温度范围为30～37 ℃[17]。由图4可知，1号和4号菌受温度的影响比3号菌大，虽然不同的菌株受温度的影响不同，但是3株菌的耐热趋势变化却一致。在4,10,20 ℃条件下生长能力较弱，随着温度增加，菌株生长能力加强，在30 ℃时生长情况最好，温度继续增加，在40 ℃时，菌株的生长能力不及30 ℃时强，但比低温情况下好，说明这3株菌的生长较耐高温。

2.6 菌株在不同pH值条件下的生长能力

菌株在不同pH值条件下的生长能力见图5。

图5 分离菌株在不同pH值条件下的生长能力Fig.5 Growth ability of isolated strains at different pH values

肉制品发酵结束后，其pH值多低于5.3[18]，菌株能在酸性条件下生长。而随着菌株生长，pH越来越低，是否能够耐酸性条件生长对于乳酸产量影响非常重要。由图5可知，在pH 3.5条件下，菌株均受到抑制，但能继续生长，在pH 4.5时，菌株受到的抑制变小，尤其是4号菌，生长情况最好，pH继续增大，1号和3号菌的生长情况明显变好，但4号菌的生长情况却不如在pH 4.5的条件下，可能是因为pH 4.5更接近于4号菌的最适生长pH。综上，3株菌均能在pH 4.5的条件下较好地生长。

3 结论

由以上研究试验可知，从发酵肉制品中分离得到的1号粪肠球菌(SIIA9047，Enterococcusfaecalis)、3号戊糖片球菌(SIIA9048，Pediococcuspentosaceus)和4号肠膜明串珠菌(SIIA9049，Leuconostocmesenteroides)均有较好的产乳酸能力，其中1号菌产生乳酸含量最高，在对盐分及亚硝酸盐耐受性上，3株菌各有优势。天然的乳酸菌产生的乳酸合成的聚乳酸更加保证了原料的天然性、安全性和环保性。聚乳酸作为近年来发展最迅速的可生物降解材料，在一次性餐饮行业的应用上具有巨大的发展潜力，正受到越来越多的关注。本研究结果为开发肉制品发酵剂和传统肉制品加工以及工业化发酵制备乳酸并将其用于聚乳酸类可降解材料的制备提供了一定的依据。