传统发酵酸乳中乳酸菌的分离鉴定

张甜，刘艳全，丁真真，努尔马木提·买买提江，龚国利

(1.喀什大学 生命与地理科学学院，新疆 喀什 844000； 2.陕西科技大学 食品与生物工程学院，西安 710021)

乳酸菌是一类微需氧、厌氧或兼性厌氧的，能够发酵糖类产酸的一类革兰氏阳性菌，细胞形态为杆状或球状[1,2]，乳酸菌种类繁多，因其较高的营养价值而被广泛应用于保健食品、婴幼儿食品和饲料中。如自然发酵的泡菜、混菌发酵的乳制品(发酵乳饮料、酸奶、干酪等)和青贮饲料，乳酸菌都是必不可少的菌种[3]。乳酸菌是人和动物肠道中的有益菌群，大量的动物试验和临床试验证明发酵产品能够改善乳糖不耐症，而有些乳酸菌可粘附在机体肠道中，形成生理屏障，抵御有害菌，预防食物过敏，促进肠道蠕动，帮助机体消化，调节机体免疫功能，降低胆固醇，降血压等。在食品的乳酸菌发酵过程中，乳酸菌生成的乳酸、醋酸等有机酸及醇类等可抑制有害物质的生成，提高食品的保鲜度，大大提高食品的营养价值，容易消化吸收，有益于老人和儿童食用[4]。

本研究以喀什市、疏勒县、疏附县的传统发酵酸乳为样品，筛选理化性能较好的乳酸菌，对乳酸菌的开发和保藏有一定意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 乳酸菌分离样品

采集自喀什市、疏勒县、疏附县的自然发酵酸奶，于4 ℃保存，带回实验室备用。

1.1.2 试剂

细菌基因组提取试剂盒：北京天根生化有限公司；2×Power Taq PCR MasterMix、DL2000 Marker：北京百泰克生物技术有限公司；PCR引物、琼脂糖：上海捷瑞生物公司。

1.1.3 试验仪器

双人单面净化工作台 苏州净化设备有限公司；生物显微镜 麦克奥迪实业集团有限公司；电子天平 上海众渊实业有限公司；立式压力蒸汽灭菌锅 上海博讯实业有限公司；恒温培养箱 上海青海仪器有限公司；PCR仪、5430R高速冷冻离心机、移液器 德国Eppendorf公司；电泳仪 北京六一仪器厂；JY04S-3C凝胶成像系统 北京君意东方电泳设备有限公司。

1.1.4 培养基

MRS肉汤培养基[5]：蛋白胨1%，酵母浸粉0.5%，牛肉膏1%，K2HPO40.2%，柠檬酸二胺0.2%，醋酸钠0.5%，葡萄糖2%，吐温-80 0.1%，MgSO4·7H2O 0.06%，MnSO4·4H2O 0.025%。

MRS固体培养基：向肉汤培养基中加入1.5%～2%的琼脂。

用醋酸调节pH至6.2～6.4，121 ℃灭菌15 min。

MC培养基[6]：大豆蛋白胨0.5%，牛肉浸粉0.3%，酵母浸粉0.3%，葡萄糖2%，乳糖2%，碳酸钙1%，琼脂1.5%～2%，中性红0.005%，pH值6.0，121 ℃灭菌15 min。

脱脂乳培养基：将牛乳煮沸30 min，过夜冷却，除去上层乳脂即制得脱脂乳。将脱脂乳置于三角瓶或试管中，108 ℃蒸汽灭菌15 min，即得脱脂乳培养基。

1.2 方法

1.2.1 菌种分离方法

样品→梯度稀释→分离→纯化→革兰氏染色→斜面保藏→耐盐测定→耐酸测定→DNA提取→16S rRNA序列扩增→遗传关系分析。

1.2.2 样品分离、纯化和保藏

称取10 g酸奶样品，置于含有90 mL无菌水的250 mL烧瓶中，晃动均匀，获得10-1酸奶稀释液，10倍梯度稀释后，得到10-2～10-8稀释液，将稀释液各取1 mL，用温度降至45 ℃的MRS固体培养基浇注，42 ℃培养24 h。

挑选MRS固体培养基上长势良好的菌株接种于MC培养基上，挑选含有透明圈的单菌落反复划线，42 ℃培养，将纯化到的菌株接种于MRS固体斜面培养基上，待长出菌苔后于4 ℃保藏。

1.2.3 初步鉴定

形态观察：对纯化后获得的菌株，观察其基本形态特征，并进行革兰氏染色，镜检观察菌体的大小、颜色、形状和排列方式[7]。

1.2.4 理化因素对菌株生长的影响

凝乳时间的测定：按3%的接种量，将培养好的MRS液体培养物接入10 mL已灭菌的脱脂乳培养基中，培养温度为42 ℃，观察并记录凝乳时间；耐盐能力的测定：将筛选出的凝乳时间较短的菌株按10%的接种量分别接种于含盐量1%、3%、5%、7%、9%的MRS肉汤培养基中，以不含盐的10%接种量的MRS培养液为对照，在42 ℃恒温箱中静止培养24 h后测定乳酸菌的存活率[8]；耐酸能力的测定：将筛选出的凝乳时间较短的菌株按10%的接种量分别接种于pH 2，3，4，5的MRS肉汤培养基中，在42 ℃恒温箱中静止培养2 h后测定乳酸菌的存活率[9,10]。

1.2.5 乳酸菌的16S rRNA基因序列与遗传分析

使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取乳酸菌的基因组，利用细菌通用引物27f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492f(5′-GGTTACCTTGTTACGGACTT-3′)对16S rRNA基因进行扩增。PCR反应体系为DNA模板2 μL，引物各2 μL，2×Power Taq PCR MasterMix 25 μL，补充ddH2O至50 μL。反应条件：94 ℃ 10 min，94 ℃ 30 s，54 ℃ 60 s，72 ℃ 90 s，35个循环，72 ℃ 10 min，4 ℃保存。PCR产物将送至苏州金智维有限公司进行测序。将测序结果利用NCBI数据库的Blast工具进行序列同源性搜索，选取数据库中相似度高的16S rRNA序列，通过MEGA 7.0软件分析乳酸菌的遗传关系并构建系统发育进化树[11]。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌的筛选

将采集的3个酸奶样品，根据上述乳酸菌的分离方法获得乳酸菌菌落[12]。挑取长势优良、透明圈明显的单菌落进行平板划线分离，获得9株菌株，分别为F1、F2、F3、K1、K2、K3、L1、L2、L3，观察菌落特征，大多为圆形，乳白色或白色，表面较光滑。并对菌株进行革兰氏染色，染色结果见图1。9株菌株均为阳性，菌体形态大体可分为杆状和球状，具体表型特征见表1。

图1 9株菌株的革兰氏染色(×100)Fig.1 Microscopic observation of 9 strains after Gram staining(×100)

表1 菌株的形态特征Table 1 Morphological characteristics of strains

2.2 理化因素对菌株生长的影响

2.2.1 凝乳时间的测定

将培养好的MRS液体培养物以3%的接种量接入10 mL已灭菌的脱脂乳培养基中，42 ℃培养，观察并记录凝乳时间，结果见图2，挑选出凝乳时间较短的6株菌株K3、L1、L2、L3、F1、F2。

图2 凝乳试验Fig.2 Curd test

结合菌株形态观察、革兰氏染色和凝乳试验，初步确定6株菌株为乳酸菌，并进行耐盐和耐酸能力测定。

2.2.2 耐盐能力的测定

图3 不同盐浓度下活菌存活率Fig.3 Survival rates of live bacteria at different salt concentration

将6株菌株按10%的接种量分别接种于含盐量1%、3%、5%、7%、9%的MRS肉汤培养基中，以不含盐的10%接种量的MRS培养液为对照，在42 ℃培养24 h后测定乳酸菌的存活率，结果见图3。

由图3可知，L1在5%盐浓度时存活率达到45.95%，其余5株菌株的耐盐性一般，L2的耐盐性最差，F1在盐浓度9%时停止生长。

2.2.3 耐酸能力的测定

将6株菌株按10%的接种量分别接种于pH 2，3，4，5的MRS肉汤培养基中，在42 ℃恒温箱中静止培养2 h后测乳酸菌的存活率，结果见图4。F1在pH 2时存活率为6.33%。

图4 不同pH值下活菌存活率Fig.4 Survival rates of live bacteria at different pH values

由图3和图4可知，菌株的耐盐度和耐酸度各有不同，但是随着盐浓度升高和酸度不断下降，乳酸菌的活菌数也随之降低，菌株的生长受到抑制。

2.3 乳酸菌的16S rRNA基因序列与系统发育分析

2.3.1 乳酸菌的16S rRNA基因序列扩增[13]

以6株乳酸菌的基因组为模板，进行16S rRNA片段扩增，利用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，约在1500 bp左右，结果见图5，PCR产物送至苏州金智维有限公司进行测序。

图5 PCR扩增产物电泳结果Fig.5 Electrophoresis results of PCR amplified products

2.3.2 乳酸菌的系统发育分析

将测序结果利用NCBI数据库的Blast工具进行序列同源性搜索，选取数据库中相似度高的16S rRNA序列，见表2。

表2 菌株同源性分析Table 2 Homology analysis of strains

由表2可知，K3、L1、L2与德氏乳杆菌(Lactobacillusdelbrueckii)序列相似性达到100%，L3、F1、F2与发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)序列相似性达到100%，通过MEGA 7.0软件分析乳酸菌的遗传关系并构建系统发育进化树，结果见图6。确定K3、L1、L2为德氏乳杆菌(Lactobacillusdelbrueckii)，L3、F1、F2为发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)。

图6 基于16S rRNA序列乳酸菌的系统发育树Fig.6 Phylogenetic tree of lactic acid bacteria based on 16S rRNA gene sequence

3 结论

本试验以喀什市、疏勒县和疏附县采集的传统发酵酸奶为样品，分离乳酸菌，结合菌落形态和细胞形态特征以及菌株的凝乳试验，筛选出6株菌株(K3、L1、L2、L3、F1、F2)，均为革兰氏阳性菌，通过耐盐和耐酸试验，得知菌株L1在5%盐浓度、培养24 h时存活率达到45.95%，其余5株菌株的耐盐性一般，F1在盐浓度9%时停止生长，但F1在pH 2、培养2 h时存活率为6.33%；提取6株菌的基因组并进行16S rRNA序列扩增、测序，序列比对后，初步确定K3、L1、L2为德氏乳杆菌(Lactobacillusdelbrueckii)，L3、F1、F2为发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)。