川南麸醋入池发酵过程中理化指标变化规律研究

衡小成，毛祥，黄丹,2,3，颜琴玲，叶光斌,2*

(1.四川轻化工大学 生物工程学院，四川 宜宾 644000；2.四川轻化工大学酿酒生物技术 及应用四川省重点实验室，四川 宜宾 644000；3.四川省川南晒制麸醋 生物酿造技术工作实验室，四川 宜宾 644000)

传统麸醋以麸皮为主要原料，糖化、酒化、醋化同池发酵，并采用翻醅、低温、固态发酵，其过程是经典的生料固态多菌混合发酵，产品风味独特[1]。传统麸醋工艺首先是制作醋母，将大米(糯米)浸泡，煮至没有米芯，冷却后加药曲，中途每天搅拌，直到不冒泡，变酸即可使用。然后将醋母和麸皮按比例拌和后入池发酵，前期盖上草席。入池发酵完成后装坛晒醅。最后淋醋(套淋)、灭菌，即可装瓶。与镇江香醋、山西老陈醋、福建红曲醋相比[2-4]，传统的麸醋是唯一的药醋，药曲在制作过程中添加了许多中药，如川芎、母丁、五味子、白寇、苍术、花丁等名贵药材，使成品醋具有色泽黑褐、味道幽香、久存而不腐的品质[5]，传统麸醋都有长时间的晒醅过程，原料经过第一次入池发酵后，装坛密封，再经历几年的露天晒醅，从而形成麸醋极具特色的风味。传统麸醋糖化、酒化、醋化在一池内各个阶段都有发生，生成的糖类物质可迅速转化为乙醇，而生成的乙醇等物质在微生物的作用下又转化为乙酸等其他酸类物质，所以不会有糖类或乙醇含量过大的影响，而进一步影响发酵等其他问题。糖化、酒化、醋化使麸醋醋醅发酵过程中微生物生长、繁殖和代谢始终处于一个适宜的环境，糖、酒、醋源源不断交替生成，最终使四川麸醋具有独特的圆润、幽香、醇厚的风味特色[6]。川南麸醋的大致生产流程见图1。

图1 川南麸醋的大致生产流程Fig.1 General production process of southern Sichuan bran vinegar

近年来，国内外对麸醋的研究大多是对功能菌的筛选、风味物质的检测、氨基酸的检测及微生物群落结构的研究，如陈卓等[7]、于华等[8]对四川麸醋中产酸菌的分离鉴定；Zhang Liqiang等[9]以淀粉酶芽孢杆菌接种的发酵剂对保宁麸皮醋中乙酰丙酮和四甲基吡嗪进行改良；刘芳等[10]、刘有晴等[11]对四川麸醋发酵过程中有机酸和氨基酸含量的变化进行分析；张奶英、甘兴[12]对发酵过程中微生物群落动态演替进行分析。这些研究为食醋行业提供一些较为重要的应用参考和理论依据，给麸醋生产研究提供了意见和建议。但是目前国内外对麸醋的理化性质研究还处于起步阶段，在实际生产中还存在酶活力低和发酵过程不稳定等因素，且目前麸醋的酿造还存在发酵周期长、原料利用率低等问题。麸醋的基础研究还相对薄弱，关于川南麸醋发酵过程中理化指标变化规律的研究鲜见报道[13]。

本实验对川南某醋厂醋醅入池发酵过程进行跟踪检测，通过对醋醅的水分、淀粉、还原糖、酒精、氨基酸态氮、不挥发酸和挥发酸7项理化指标进行检测分析，为川南麸醋发酵是“三边发酵”提供了理论依据，同时也使研究结果可以有效指导麸醋的日常生产。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

川南某醋厂其中一个发酵池于2019年3月投料，其发酵周期为0～13 d，每天翻醅前取样，共14个样品。

甲醛、冰乙酸、亚铁氰化钾、氢氧化钠、葡萄糖、重铬酸钾、酒石酸钾钠、浓硫酸、酚酞、盐酸、乙酸铅、硫酸钠、石油醚、乙酸锌：以上试剂均为分析纯，成都市科隆化学品有限公司。

1.2 仪器与设备

BG2-140干燥箱 上海博讯实业有限公司医疗设备厂；FE288酸度计、ME20E/02电子天平 梅特勒-托利多仪器有限公司；ZXC-2磁力搅拌器 北京中兴伟业仪器有限公司；UR118K0004紫外分光光度计 翱艺仪器(上海)有限公司；HH-S4A水浴锅 北京科伟永兴仪器有限公司；超纯水器 四川优普超纯科技有限公司。

1.3 试验方法

水分的检测：采用烘干法。

氨基酸态氮的检测：采用甲醛滴定法[14]。

酒精含量的检测：醋醅中酒精含量较低，因此其测定方法参照《白酒生产技术全书》中糟醅的酒精度测定方法[15]。

还原糖的检测：采用斐林试剂法[16]。

淀粉的检测：采用斐林试剂法[17]。

不挥发酸与挥发酸的检测：采用酸碱滴定法[18]。

2 结果与分析

2.1 水分的变化

入池发酵过程水分的变化规律见图2。

图2 醋醅中水分含量的变化Fig.2 Changes of moisture content in vinegar grains

注：误差线代表标准偏差(n=3)；不同字母表示差异性显著(p<0.05)；相同字母表示差异性不显著(p>0.05)。

由图2可知，从整个发酵过程来看，水分含量在54.9%～60.2%之间上下波动，总体略有上升。原因可能是入池初期醋醅中的营养物质丰富，而且含氧量高，好氧性微生物快速生长繁殖代谢，进行有氧呼吸，代谢产生大量的水分；由于入池后醋醅表面加盖使水分散发不出去等因素。中期含水量呈现上下波动状态，可能是由于微生物在自身繁殖和代谢过程中产生水分，另外每天的翻醅会使得一部分水流失，所以呈现波动趋势，但发酵后期水分含量在一个相对平稳的状态。

2.2 淀粉和还原糖的变化

醋醅入池发酵过程中淀粉和还原糖的变化规律见图3。

图3 醋醅中淀粉和还原糖含量的变化Fig.3 Changes of starch and reducing sugar content in vinegar grains

注：误差线代表标准偏差(n=3)；不同字母表示差异性显著(p<0.05)；相同字母表示差异性不显著(p>0.05)。

醋醅中的淀粉是发酵的物质基础，微生物生长代谢需要足够的碳源物质，而糖类是微生物生长的重要能量来源。由图3可知，经过0～13 d的发酵，淀粉含量逐渐下降，从33.81 g/100 g干醅降低到26.1 g/100 g干醅，而还原糖含量在2.13～6.85 g/100 g干醅之间波动，是一个先增加后降低的过程。0～4 d淀粉含量下降明显，还原糖则一直处于上升状态。试验结果和张奶英等对四川麸醋理化指标的结果大致相同，张奶英等对醋醅中微生物变化进行了分析，出现这一现象可能是因为前期霉菌和酵母菌等微生物生长代谢旺盛，在整个微生物生态中属于优势菌，代谢产生大量淀粉酶，淀粉水解产生一些可直接利用的糖类物质，所有前期淀粉下降比较快。5～13 d淀粉变化趋于平稳，其原因可能是随着一些酸类物质的产生，醋醅的发酵环境偏酸，糖化反应相对降低，使淀粉几乎不再分解。还原糖处于波动状态主要是由于糖类物质一方面在生成，而另一方面在发酵过程中微生物代谢导致还原糖分解生成乙醇和有机酸等物质，再加上微生物之间的扰乱作用，导致还原糖含量总体处于下降趋势。

2.3 酒精含量的变化

醋醅入池发酵过程中酒精含量变化规律见图4。

图4 醋醅中酒精含量的变化Fig.4 Changes of alcohol content in vinegar grains

注：误差线代表标准偏差(n=3)；不同字母表示差异性显著(p<0.05)；相同字母表示差异性不显著(p>0.05)。

由图4可知，从整个发酵过程酒精含量的变化来看，酒精含量呈先增加后降低的变化趋势，在0.13～0.26 mL/100 g之间波动。0～4 d酒精含量上升，可能是因为入池时人工添加酵母菌，酵母菌和霉菌分泌的糖化酶将淀粉转化成葡萄糖，同时酵母菌分泌酒化酶再将葡萄糖转化为酒精。5～13 d酒精含量慢慢降低，一方面是淀粉极少被利用，糖化减弱，糖含量减少；另一方面，酒精用于醋化反应的生酸过程，酒精含量会减少，发酵步入以产酸为主的阶段，与此同时酸化和呼吸作用也都会消耗酒精，所有酒精含量逐渐减少。

2.4 氨基酸态氮的变化

入池发酵过程中氨基酸态氮含量的变化规律见图5。

图5 醋醅中氨基酸态氮含量的变化Fig.5 Changes of amino acid nitrogen content in vinegar grains

注：误差线代表标准偏差(n=3)；不同字母表示差异性显著(p<0.05)；相同字母表示差异性不显著(p>0.05)。

氨基酸不仅能使食醋形成独特的风味，而且使其更加营养，同时还是很多风味物质的前体。丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、缬氨酸等都是麸醋中常见的氨基酸[11]。由图5可知，整个发酵周期，氨基酸态氮的含量从0.42 g/100 g干醅上升到1.14 g/100 g干醅，其中0～1 d氨基酸态氮大幅度上升至0.85 g/100 g干醅；1～7 d趋于平缓；8～13 d缓慢上升。这一现象与醋醅中产生蛋白酶的微生物有密切联系，而蛋白质在蛋白酶的作用下降解后生成氨基酸等含氮物质。0～1 d随着微生物的繁殖代谢，原料分解成小分子的肽、氨基酸等，使得氨基酸态氮的含量快速上升。1～7 d氨基酸的生成和利用处于一个相对平稳的状态，而8～13 d酒精和酸的存在会使微生物数量降低，使蛋白酶等一些酶的活力下降，使氨基酸态氮上升缓慢。

2.5 不挥发酸与挥发酸的变化

入池发酵过程中不挥发酸和挥发酸的变化规律见图6。

图6 醋醅中不挥发酸和挥发酸含量的变化Fig.6 Changes of non-volatile acid and volatile acid content in vinegar grains

注：误差线代表标准偏差(n=3)；不同字母表示差异性显著(p<0.05)；相同字母表示差异性不显著(p>0.05)。

不挥发酸有乳酸、琥珀酸等，挥发酸以乙酸为主，适量的挥发酸能赋予食醋愉悦的香气，但挥发酸含量过高，则带有尖酸感和不愉快的醋味[10]。由图6可知，整个发酵过程中不挥发酸和挥发酸的变化趋势都一直上升，并伴有相随关系。不挥发酸最高达8.99 g/100 g干醅(以乳酸计)，挥发酸最高达4.71 g/100 g干醅(以乙酸计)。其中0～1 d，醋醅中不挥发酸和挥发酸含量快速上升，由于酵母等微生物的代谢作用，糖类物质被代谢成醇类、酸类等物质。甘兴[12]通过Illumina HiSeq测序分析发现，乳酸菌的多样性在酒化过程中逐渐上升，从而使发酵产生的乳酸等不挥发酸的含量增长。发酵2～7 d，不挥发酸和挥发酸上升相对缓慢。8～13 d醋酸菌和其他产酸菌起主要作用，醋醅中的乙醇转化成醋酸等物质，使醋醅中的乙醇含量减少，同时不挥发酸和挥发酸含量增加。发酵过程中产生的醇类、酸类物质等代谢产物也会影响微生物的生长和各个阶段的代谢。

3 结论

连续测定川南某醋厂入池发酵过程中7项理化指标的动态变化。发酵初期阶段，霉菌、酵母菌等一些好氧性微生物在微生物生态中占主导地位，且醋醅间隙中有空气存在，可进行有氧呼吸，从而分泌纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶、糖化酶等，将原料中的纤维、淀粉、蛋白质和其他大分子物质分解为还原糖、氨基酸等一些小分子物质。然后利用这些物质生长和代谢，生成大量水、酸、乙醇、氨基酸等。其中醋醅水分维持在54.9%～60.2%；淀粉含量的变化规律与其工艺有较大关系，经过0～13 d连续发酵，淀粉的利用率只有21.71%，有大部分淀粉不能充分利用；还原糖和酒精含量总体呈先增加后降低的趋势；氨基酸态氮含量在发酵过程中一直上升，从0.42 g/100 g干醅上升到1.14 g/100 g干醅；有机酸包括不挥发酸和挥发酸，整个发酵过程中不挥发酸最高含量达到8.99 g/100 g干醅(以乳酸菌计)，挥发酸最高含量达4.71 g/100 g干醅(以乙酸计)。

从发酵过程中多项指标变化可以看出，川南麸醋发酵过程大致分为3个阶段：0～1 d淀粉的含量以最快速度下降，所以此阶段主要为糖化阶段，同时酒精、氨基酸态氮、不挥发酸、挥发酸都快速上升，所以糖化还伴随着酒化、醋化作用；2～7 d酒精含量首先快速上升后缓慢降低，不挥发酸和挥发性酸含量也同步上升，此阶段酒化伴随着醋化，同时还有缓慢的糖化作用；8～13 d主要为醋化阶段，淀粉几乎没有被利用，还原糖含量降低，氨基酸态氮缓慢上升，酒精持续下降几乎消耗殆尽；且此阶段不挥发酸和挥性酸的含量上升。酸的不断增多除了部分耐酸的乳酸菌及醋酸菌以外，大多数微生物生长和代谢都受到抑制，风味物质如酯类、醛类、醇类、酮类等复合物大多也在这个阶段形成。因此，本试验表明川南麸醋发酵过程是典型的具有“三边发酵”过程。

研究醋醅入池发酵过程中理化指标的动态变化对于麸醋发酵质量的判断和生产过程的控制有较大的参考价值。就传统麸醋来说，生料发酵一直存在原料利用率低的问题，在发酵过程中，只有前期和后期有明显原料被利用和物质生成的现象，中间有段时间大量微生物代谢活动可能基本处于停止状态。因此，连续测定川南麸醋的理化指标为解决川南麸醋生产过程中醋醅入池发酵过程难以划分等问题提供了一些清晰的理解思路，也为川南麸醋发酵周期长、原料利用率较低等问题做了铺垫。