单肺通气对胸腹腔镜联合食管癌根治术患者肺内分流率和claudin-4蛋白的影响

张 利,高东艳,刘 伟,陈慧清

(1山西医科大学麻醉学院附属第二医院麻醉教研室,太原 030001;2山西医科大学第二医院麻醉科;*通讯作者,E-mail:2377536619@qq.com)

随着微创技术的发展,胸腔镜下食管癌根治术因其具有创伤小、疼痛轻、恢复快等优点,现已广泛应用于临床。此类手术要求术侧肺叶萎陷,而另一侧肺通气,即单肺通气(one-lung ventilation,OLV),以利于手术操作空间,但是这种非生理性的通气方式可能会导致通气血流比例失调,氧分压降低,肺内分流增加,甚至是急性肺损伤(acute lung injury,ALI)的发生。ALI的主要病理特征是肺毛细血管内皮细胞和肺泡上皮细胞损伤造成肺泡性和间质性的肺水肿。而近年来研究发现,肺泡上皮细胞屏障(alveolar epithelial barrier,AEB)比肺微血管内皮细胞屏障在抵抗ALI发生过程中作用更强[1]。肺泡上皮细胞间紧密连接(tight junctions,TJs)在肺泡上皮屏障发挥正常功能时起着决定性作用[2]。紧密连接由密封蛋白(claudins)、闭合蛋白(occludins)、连接黏附分子(junctional adhesion molecules,JAMs)和闭小环蛋白(zonula occludens,ZO)构成。研究表明在肺损伤时claudin-4蛋白可上调,从而增强肺泡上皮细胞的屏障功能[3]。本研究拟对单肺通气期间肺内分流率(intrapulmonary shunt,Qs/Qt)及claudin-4蛋白的变化规律进行深入探讨,进一步认识OLV所致肺损伤的严重程度,为日后临床工作中减轻肺损伤、加强肺保护提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

经本院医学伦理研究委员会审查并批准,患者知情同意。选取2018-04～2018-08山西医科大学第二医院收治的拟在全麻下行胸腹腔镜联合食管癌根治术患者30例,病例选择标准:美国麻醉学家协会(ASA)Ⅰ-Ⅱ级,年龄在45-59岁,体质量指数(BMI)18-25 kg/m2,术前心电图、血生化指标、电解质均在正常范围内,心、肺、肾功能良好。排除标准:①术前行放化疗、应用激素及非甾体类消炎镇痛药;②近期有急性肺部感染;③单肺通气后SpO2无法维持在90%以上者;④中途因故退出本次研究者。

1.2 主要仪器

迈瑞Mindray麻醉机WATO EX-65、迈瑞Mindray监护仪BeneView T9、罗氏cobas b 221血气分析仪、白洋G20型台式高速离心机、Rayto RT-6100酶标分析仪等。

1.3 研究方法

患者术前禁食8 h、禁水4 h,入手术室后监测心电图、血压、血氧饱和度、脑电双频指数(BIS)并给予桡动脉穿刺测压及右侧颈内静脉穿刺置管。诱导:咪达唑仑0.04 mg/kg,依托咪酯0.3 mg/kg,舒芬太尼0.5 ug/kg,顺式阿曲库铵0.15 mg/kg依次静脉注射后,行双腔气管插管,采用纤支镜进行定位,连接麻醉机,通气模式为IPPV,吸入氧浓度为100%;之后行单肺通气后使用肺保护性通气策略,潮气量:6-8 ml/kg,呼吸频率:14-16次/min,吸呼比I ∶E为1 ∶1.5,PEEP 5 cmH2O,术中限制气道压Ppeak<30 cmH2O;维持:丙泊酚6-12 mg/(kg·h),瑞芬太尼0.1-0.3 μg/(kg·min),间断追加顺式阿曲库铵。根据BIS值40-60,调节麻醉深度,术中血压波动不超过基础血压的25%。根据液体丢失量和失血量指导补液和输血。

1.4 观察指标

①分别抽取侧卧位单肺通气前10 min(T0),单肺通气后60 min(T1),恢复双肺通气后60 min(T2)的桡动脉及中心静脉血各0.5 ml,测定血气,根据公式计算肺内分流率(Qs/Qt):Qs/Qt=(CcO2-CaO2)/(CcO2-CvO2)×100%。

其中CcO2为肺毛细血管末段血液氧含量,CcO2=Hb×1.39×SaO2+(PAO2×0.003 1),Hb为患者血红蛋白量,SaO2为动脉血氧饱和度,PAO2为肺毛细血管氧分压。PAO2=FiO2×(Pb-PH2O)-(PaCO2/0.8),FiO2为吸入气氧浓度,Pb为大气压(760 mmHg),PH2O为大气中水蒸气压(47 mmHg)。CaO2为动脉血氧含量,CaO2=(1.34×Hb×SaO2)+(0.003 1×PaO2);CvO2为静脉血氧含量,CvO2=(1.34×Hb×SvO2)+(0.003 1×PaO2)。SvO2为混合静脉血氧饱和度。近似认为混合静脉血氧饱和度与中心静脉血氧饱和度相等。所有测量均未在术者钳夹支气管或者肺血管等影响肺内分流的操作时进行。

②分别抽取侧卧位单肺通气前10 min(T0),单肺通气后60 min(T1),恢复双肺通气后60 min(T2)时的中心静脉血3 ml,离心后置于-80 ℃的冰箱保存,通过酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清中claudin-4蛋白的浓度,按人紧密连接蛋白-4(claudin-4)酶联免疫分析试剂盒(购自ZYMED公司)说明书操作如下:用纯化的人紧密连接蛋白-4(claudin-4)抗体包被微孔板,制成固相抗体,往包被单抗的微孔中依次加入紧密连接蛋白-4(claudin-4),再与HRP标记的紧密连接蛋白-4(claudin-4)抗体结合,形成抗体-抗原-酶标抗体复合物,经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下最终转化为黄色。颜色的深浅和样品中的紧密连接蛋白-4(claudin-4)呈正相关。用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度(OD值),通过标准曲线计算样品中人紧密连接蛋白-4(claudin-4)浓度。观察比较不同时段(T0,T1,T2)该数值的变化情况。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 患者基本情况

本组患者共30例,其中女性13例,男性17例,平均年龄为54岁,身高为(165.8±7.8)cm,体质量为(62.5±6.5)kg,麻醉时间为(375.5±37.1)min,手术时间为(325.0±30.3)min,单肺通气时间为(156.5±19.7)min。

2.2 肺内分流率及claudin-4蛋白含量

肺内分流率进行重复测量方差分析,球形度检验结果χ2=3.026,P=0.216;claudin-4进行重复测量方差分析,球形度检验结果χ2=3.610,P=0.164。二者均符合正态分布及方差齐性,可以直接进行重复测量方差分析。

肺内分流率在不同时间点比较差异有统计学意义,T1时刻相比于T0时刻有明显升高,T2时刻与T1时刻比较有明显降低,但T2时刻与T0时刻比较差异无统计学意义;claudin-4蛋白浓度在3个时间点的比较,差异有统计学意义,T1,T2时刻大于T0时刻(P<0.05),T2较T1时刻有所降低,但差异无统计学意义(见表1)。

表1 claudin-4与肺内分流率在不同时间点的比较

Table 1 Changes of claudin-4 and intrapulmonary shunt rate at different time points

时间点claudin-4(ng/ml)肺内分流率(%)T06.15±0.6012.41±2.43T114.44±1.31∗28.03±4.01∗T212.46±0.92∗13.90±3.83#

与T0比较,*P<0.05,与T1比较,#P<0.05

2.3 肺内分流率与claudin-4的相关性

在不同时间点,肺内分流率与claudin-4进行Pearson相关分析,结果显示两者无相关性(见表2)。

表2 Claudin-4与肺内分流率不同时间点的相关性分析

Table 2 Correlation analysis between claudin-4 and intrapulmonary shunt rate at different time points

时间点rPT0-0.080.68T1-0.210.26T20.060.74

3 讨论

单肺通气(OLV)作为现代胸科手术必要的一种通气方式,在为手术提供良好的视野的同时,也导致了一系列的并发症。OLV时,萎陷的肺有血流而无通气,而另一侧肺虽有通气,但是侧卧位也导致了肺血流的增加,通气/血流(V/Q)减低,从而产生了肺内分流以及低氧血症[4]。研究表明,缺氧时机体可以启动内源性缺氧性肺血管收缩(hypoxic pulmonary vasoconstriction,HPV)机制,从而减少肺内分流,该效应在OLV后15 min开始出现,于45-60 min达到高峰[5,6]。本研究发现,与T0相比,T1时间点PaO2明显降低,Qs/Qt较T0增加,T2与T0相比PaO2及Qs/Qt无明显差异,表明单肺通气可以导致肺内分流率的增加,但是在恢复双肺通气后可逐渐恢复。我们发现,在侧卧位双肺通气T0点时也会发生肺内分流,这是由于侧卧位时下侧肺受重力影响,肺血流增加,但是肺的顺应性减低,通气反而减少,进而导致了肺内分流[7]。

除了以往公认的肺通气血流比例失调外,越来越多的研究表明OLV是引起肺损伤的独立危险因素[8]。任何OLV都是非生理性的,均可导致组织性肺损伤。在胸腔镜手术过程中,通气侧肺因肺泡过度通气、反复萎陷/复张,非通气侧肺因灌注减少及手术牵拉刺激等均可进一步诱发肺损伤[9,10]。在众多的病因中,肺泡细胞过度膨胀以及终末呼吸单位随通气反复开放与闭合导致的肺泡上皮屏障的破坏是一个重要的病理生理改变[11,12]。而肺泡上皮屏障发挥正常功能则是依靠上皮细胞间的紧密连接(tight junctions,TJs)。Furuse等[13]发现证实了claudin蛋白是细胞间紧密连接的主要功能蛋白。到目前为止,在人类中已发现有27个家族成员[14]。claudin在皮肤、脑、内脏组织中均有特异性表达[15]。有研究显示肺部有多种claudin蛋白表达,包括:claudin-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-8、-18[16-19]。其中以claudin-3、-4、-18在肺上皮中表达最多,而claudin-4则已被证实参与对抗肺损伤[20]。且相比于claudin-3、-18,claudin-4在肺损伤时表达更为特异[3]。claudin蛋白可以通过和同一细胞或相邻细胞中的claudin蛋白发生关联以形成细胞旁渗透性屏障的基础[21,22],从而维持细胞内环境的平衡。

研究发现,肺损伤时,细胞外环境因素的刺激会改变claudin蛋白表达进而影响肺泡上皮屏障功能。至今为止,有关肺损伤时claudin蛋白变化的文章甚少且大部分都停留在动物试验阶段。郑悦亮等[23]通过脂多糖诱导的肺损伤小鼠模型试验发现,大蒜素可以通过上调claudin-4的表达从而显著改善肺损伤。Wray等[3]发现在机械通气所致肺损伤小鼠中claudin-4 mRNA表达特异性增高,同时没有其他claudin显示mRNA表达2倍以上的变化,然后用CPE BD和siRNA抑制claudin-4表达后则导致了肺水肿的发生,表明claudin-4蛋白可保护上皮的屏障功能并限制损伤期间肺水肿的发生。Kage等[24]的试验同样证实了claudin-4对急性肺损伤有保护作用。

本研究发现,与侧卧位双肺通气时相比单肺通气1 h时claudin-4蛋白浓度有明显升高,这与Wray等的研究结果一致,但二者升高的倍数不同,这可能与研究对象及检测时间不同有关。本研究选用的是人实施单肺通气后所致的肺损伤,且术中使用了肺保护通气策略,而Wray选用的为呼吸机诱导的肺损伤小鼠模型,两者损伤程度不同。我们还发现,在恢复双肺通气1 h后,claudin-4较单肺通气时稍有降低,这可能与恢复双肺通气后肺损伤不再加重有关,但是机体的自我代偿能力有限,claudin-4在较短时间内无法恢复至术前水平。同时我们发现claudin-4与肺内分流率二者之间无相关性,这可能与下列原因有关:①因为相关研究仅见于动物实验,且观察的时间较长,而本研究因特定的手术时长,选取的观察时间点有限;②本次研究选取的样本量小,有待于后期行大样本研究。

以上结果初步证实了肺内分流率及紧密连接蛋白claudin-4在OLV期间的变化规律,单肺通气可导致肺内分流率增加,表明这种非生理性的通气方式会对肺脏造成一定的损伤,而claudin-4可以在肺损伤早期代偿性上调,从而增强上皮屏障功能,起到肺保护的作用。本实验作为本课题组在人体上探究claudin蛋白表达的前期研究,希望可以在后期寻求更多的claudin蛋白以反映肺损伤,从而为临床工作提供一定的理论基础。