肺炎球菌溶血素在社区获得性肺炎心肌损伤中的作用

王静 荣柏洋 牛慧 朱文凯 赵志鹏 谢建军 胡曼青

肺炎球菌是引起社区获得性肺炎(community-acquired pneumonia，CAP)常见的病原微生物。CAP与心血管并发症的短期和长期风险增加有关[1]。常见的心血管并发症包括急性心肌梗死、新发心律失常和心力衰竭等。重症肺炎、高龄和既往心血管疾病病史是出现心脏并发症的风险因素。研究发现，肺炎球菌溶血素(Pneumolysin，PLY)具有胆固醇结合活性，是肺炎球菌的主要蛋白质毒力因子。PLY在心肌细胞损伤和CAP相关心血管事件中起关键作用。PLY可能通过直接细胞毒性和间接促炎及促血栓形成作用，成为引起心肌细胞损伤的关键介质[2]。本文就近年来对PLY的生物活性、引起心肌细胞损伤的机制及防治策略予以探讨。

PLY的生物活性

PLY由471个氨基酸组成，分子量53kDa，是肺炎球菌的主要蛋白质毒力因子，含有四个不连续的功能结构域。结构域1～3共同赋予结构稳定性，结构域4包含细菌胆固醇依赖性溶细胞素(bacterial cholesterol-dependent cytolysin，CDC)家族所有成员，介导PLY与真核细胞膜结合[3]。PLY位于肺炎球菌细胞质，通过自溶机制或经β-内酰胺类抗生素作用后释放出来。与其他细菌CDC不同，由于缺乏典型的N末端信号分泌前导序列，PLY不被肺炎球菌主动分泌。在某些血清型肺炎球菌的细胞壁中检测到PLY的活性形式，取决于跨膜辅助分泌系统SecY2A2因子的活性，有利于增强细菌侵袭力和维持持续感染[4]。

PLY是一种重要的成孔毒素。孔结构形成依赖结构域4的疏水附着区与真核细胞膜胆固醇头部基团的相互作用。结构域4中L1环中的苏氨酸-亮氨酸与胆固醇结合后，十一肽序列穿插入膜中，形成毒素寡聚化单体。经过中间预孔的自组装，最终形成由42个毒素单体组成，最大直径为400A的跨膜管孔[5]。在高浓度下，PLY诱导细胞膜不可逆的孔结构形成，造成细胞外Ca2+内流，细胞内Ca2+超负荷，K+外流，膜去极化和细胞高反应性，导致多种类型的细胞溶解。包括红细胞、血小板、先天和适应性免疫细胞、心肌细胞和各种类型上皮细胞和内皮细胞等。不同细胞对PLY溶细胞作用的敏感性有所差异。PLY的细胞毒活性引起免疫抑制和组织损伤，有利于肺炎球菌肺外传播和持续感染。在亚致死浓度下，由于PLY诱导形成的孔结构短暂而可逆，对于先天免疫系统和血小板，可能引起促炎和促血栓形成作用的过度活化[6]。

PLY引起心肌细胞损伤的机制

一、PLY的直接心脏毒性

心血管事件是CAP常见的并发症之一，发生率高达30%。CAP患者出现心血管并发症使CAP相关30天的死亡率增加了5倍，并与出院后长期死亡率增加和心血管事件复发风险增加有关[7]。研究发现，在感染肺炎球菌TIGR4或D39菌株的实验小鼠，PLY参与了对心肌细胞的损伤作用。实验中，通过腹膜接种或气道途径感染肺炎球菌，感染后12～30小时内小鼠血液中细菌数量呈线性增加。随后出现心电图动态变化及循环心肌肌钙蛋白-I浓度持续增加，表明存在心肌细胞损伤和功能异常。活组织分析显示，心肌细胞中存在微小病变，病变心肌包含肺炎球菌聚集体和少量炎症细胞，这在肺炎球菌TIGR4菌株感染中最为明显。另外，通过眼眶后静脉窦注射重组PLY，在心脏微血管系统引起明显损伤和炎症迹象。同样的微小病变并未在肝脏、脾脏或肾脏中检测到，表明PLY可能具有嗜心肌细胞毒性作用[8]。

有学者发现，基于肺炎球菌CbpA基因，采用小鼠磷酸胆碱结合血小板活化因子引起受体基因失活，用重组CbpA预先免疫小鼠可起到保护作用，表明PLY参与了心肌细胞侵袭。此外，通过敲除病原体的PLY基因，以及通过用PLY疫苗预先免疫小鼠，使PLY的成孔活性减弱，可减轻心肌细胞的微小损伤；在体外实验也观察到易感心肌细胞易受PLY的细胞毒作用的影响。这些实验支持PLY在介导心肌细胞直接损伤的证据，涉及免疫静息和促凋亡机制等方面。

二、PLY的间接促炎及促血栓形成作用

肺炎球菌肺炎是CAP患者急性心血管事件的独立危险因素。侵袭性肺炎球菌感染与明显的血小板活化和高反应性相关[9]。血小板是急性心血管事件的关键细胞，血小板高反应性可能导致肺炎球菌感染患者血栓形成风险增加。血小板在急性心血管事件和动脉粥样硬化中起重要作用。并发心肌梗死的CAP患者血小板活化血浆标志物增加。肺炎球菌对血小板的直接刺激诱导明显的血小板活化和高反应性，模型猪洗涤血小板在体外暴露于肺炎球菌可被激活。肺炎球菌除了通过与血小板Toll样受体(TLR)-2，FcγRIIA和整合素αIIbβ3结合，直接激活血小板外，也可通过PLY诱导的中性粒细胞和血小板促炎及促血栓形成作用，间接参与严重肺炎球菌感染期间心肌细胞的损伤过程[10]。另外，PLY介导的亚裂孔形成和Ca2+的流入，进一步引起暴露于PLY的血小板和中性粒细胞活化，并导致前粘附整合素GPIIb/IIIa以及CD62P的表达上调，分别诱导同型血小板聚集及中性粒细胞与血小板相互聚集。血小板诱导的中性粒细胞过度活化，促进各种血栓形成，发挥联结先天性和适应性免疫应答的桥梁作用[11]。

研究发现，中性粒细胞暴露于纯化PLY中，可促进中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps，NET)作用。在诱导NET形成过程中，核小体进一步浓缩，衍生出新生蛋白质颗粒，通过高迁移率族蛋白B1呈递，外排到细胞外，加强中性粒细胞贴壁血小板。同时，肺炎球菌进入血循环后，产生血管内宿主先天免疫应答。若免疫应答失控，易在冠状动脉内形成血栓的潜在危险[12]。NET也可通过表达组织因子，结合和活化血小板，激活内在凝血系统，并使内源性抗凝血因子失活，进而促进血栓形成。NET激活动静脉血管内凝血后，可增加血栓脱落和动脉直接闭塞的风险，导致心肌缺血，甚至心肌梗塞[13]。

关于PLY靶向治疗策略的最新进展

近年来，临床开展了一系列针对PLY的靶向治疗，例如大环内酯类抗生素的靶向抗炎活性，CDC-多价螯合脂质体，全人源化毒素中和单克隆抗体的早期临床评价。取得了初步的治疗效果。

对于肺炎球菌CAP患者，大环内酯类抗生素除了主要的抗菌作用外，还有独特的中性粒细胞靶向抗炎活性[2]。有研究比较了ICU严重肺炎球菌CAP患者，不同抗生素联合和不同给药时间对死亡率的影响。结果显示，接受β-内酰胺单药治疗或β-内酰胺/大环内酯联合治疗的患者死亡率分别为13.8%和1.8%(P<0.001)。研究认为，大环内酯类靶向抑制细菌50S核糖体，与肽链末端结合并干扰肽链延伸，减弱PLY和其他细菌蛋白毒素的合成，减轻继续使用β-内酰胺抗生素潜在有害的过度炎症反应[14]。因此，联合大环内酯类抗生素治疗比接受单药治疗，可以明显降低肺炎球菌CAP患者的死亡率。这与大环内酯类抗生素通过双重作用机制，对抗PLY的毒性作用有关。另外，严重CAP患者，给予β-内酰胺抗生素和大环内酯类联合，给药时间和顺序可能影响临床效果。对于肺炎球菌CAP，β-内酰胺抗生素用药之前给予大环内酯类获益更大，大环内酯类药物对中性粒细胞的靶向抗炎活性可能仅在β-内酰胺类药物给药前最为显著。因此，研究建议，联合用药时，大环内酯类应首先输注，随后再给予β-内酰胺抗生素，联合用药时间最好在2小时左右[15]。

对CDC-多价螯合脂质体也进行了相关的动物实验研究和早期临床评估。动物实验应用的脂质体为含有1：1胆固醇/鞘磷脂(66mol%胆固醇)的混合物，静脉内以100 mg/kg体重的剂量预处理小鼠，可以显著减轻实验性IPD小鼠的心肌细胞损伤，对抗细菌成孔毒素的有害影响[16]。早期临床评估的脂质体CAL02为非抗生素脂质体药物，可中和PLY，防治严重感染和并发症，提高抗生素疗效。该药物已经完成严重肺炎球菌CAP的初步安全性评价，符合设计的安全性和耐受性指标。13例入组的重症CAP患者中，低剂量组有1例死于研究药物无关的合并症，其他12例患者均达到临床治愈。连续器官功能障碍评分CAL02组平均降低65.0%,安慰剂组为29.2%(P<0.01)。该研究结果为继续对CAL02进行深入临床研究提供了基础[17]。

另外，基于PLY中和单克隆抗体(monoclonal antibodies，MAbs)治疗策略的实验研究也在进行中。初步研究表明，用致死剂量的肺炎球菌经鼻腔感染小鼠，给予PLY中和抗体后，小鼠平均存活时间显著增加[18]。ASN100是细菌成孔毒素的靶向治疗抗体，包含两种完全人源化的单克隆抗体ASN-1和ASN-2，基于MAbs的PLY靶向免疫疗法可作为抗生素的辅助手段，通过中和细菌毒素和毒力因子以杀死细菌或减弱细菌的病理活性，用于预防ICU入院的呼吸机相关性肺炎高危患者。而Arsanis开发的抗肺炎球菌MAbs(ASN400)的实验尚在进行中，等待研究结果的最终揭示[19]。

综上所述，PLY是肺炎球菌的主要蛋白质毒力因子，在肺炎球菌CAP的发病机制中起发挥重要作用。PLY介导的直接心肌细胞毒性和间接促炎及促血栓形成作用，参与心肌细胞损伤和功能障碍。PLY的靶向治疗策略，目前处于评估的临床前阶段，可能会对严重肺炎球菌CAP患者的抗生素辅助治疗策略产生重大影响。