儿童耐药肺炎支原体DNA拷贝量与临床预后相关性分析

朱美君

肺炎是常见的儿童疾病之一，患儿主要出现发热、干咳、咳痰等临床症状[1]。近年来支原体肺炎的发病率逐渐升高，发病急、病情重。临床上肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae，MP)引起的呼吸系统疾病不易与其他病原体区分，为临床诊治带来一定挑战。MP无细胞壁，对糖肽类、β-内酰胺类药物具有天然抗性，目前对于MP的治疗主要采用红霉素、克拉霉素、罗红霉素、阿奇霉素等，但由于近年来大环内酯类抗生素的滥用，MP菌株对大环内酯类药物出现明显的耐药性[2]。MP临床分离培养较为困难，目前关于MP的耐药性机制尚不完全清楚。研究报道，耐药MP引起患儿治疗时间及临床症状持续时间延长，耐药MP与患儿的临床预后具有一定的相关性[3]。但关于耐药MP-DNA拷贝量是否与临床预后相关则未见报道，本文通过检测耐药MP-DNA拷贝量，分析其与临床预后的相关性。

资料与方法

一、一般资料

2017年12月至2018年12月于本院儿科就诊的合并发热或(和)咳嗽，且1年内反复MP感染且不规律应用大环内酯类抗菌药物≥2次的110例患儿纳入研究组。患儿中男66例，女44例，年龄1～8岁，平均(6.30±1.24)岁。纳入标准：①年龄1～8岁，患者入院前未进行抗生素、免疫抑制剂等治疗；②患儿肺部有湿啰音或哮鸣音；③患儿依从性好，家属知情同意；④本研究经医院伦理委员会批准。排除标准：①患有免疫缺陷性疾病患儿；②患有肺结核或者哮喘等呼吸系统疾病者；③阿奇霉素过敏或者有严重反应不良患儿；④伴有先天性疾病患儿。

二、方法

1 MP培养及药敏试验 用无菌棉拭子在患儿咽喉部捻转数次采集咽拭子标本，把被检测的棉拭子置于含有快速MP培养基的分离培养瓶中，37℃培养箱中培养24h。阳性判断：MP繁殖过程中分解糖类，形成 H+，引起培养基的pH值降低，指示剂颜色由红色变为黄色；阴性：培养基颜色变浑浊或者保持不变。本次药敏试验共检测5种抗菌药物(红霉素、罗红霉素、阿奇霉素、克拉霉素、加替沙星)，根据药物浓度由高到低，于体外对MP抑制抗菌药物作用进行病原体耐药性分析。

实验步骤：取1支分装的阿奇霉素干粉培养基，加入1.5 mL无菌水溶解；在药敏阴性孔中加入50 uL培养基，将采集的MP标本咽拭子在培养基中搅动数次，取50 uL含有MP标本的培养液加入药敏板，置于37℃培养箱中培养24h。药敏试验判定标准[4]：MP培养基上C孔为澄清蓝色，则为MP阳性(+)；C孔培养基不变，则为MP阴性(-)。药物敏感：A、B孔MP均为阴性(-)；重度敏感：A孔MP为阴性(-)、B孔MP为阳性(+)；耐药：A孔MP为阳性(+)、B孔MP为阳性(+)。重度敏感按照敏感进行处理。

2 疗效判定标准 依据国家卫生计生委办公厅、国家中医药管理局办公室、解放军总后勤部卫生部药品器材局发布的《抗菌药物临床应用指导原则(2015年版)》[5]将治疗效果分为无效、进展、显效、痊愈4级。有效率=(显效例数+痊愈例数)/总例数×100%。

3 荧光定量PCR 采用高温消毒的吸痰器于患儿咽部吸取痰液1～3 mL置于无菌试管中；4倍体积4%的NaOH室温消化30min，取1 mL至离心管中，加入浓缩液100 uL，12000r/min离心5min，弃上清，沉淀中加入50 uL核酸释放剂；加50 uL DNA提取液于MP-DNA检测管中，于ABI7500 Real Time 荧光定量PCR仪中检测MP-DNA载量，依据试剂盒说明书分析检测结果。

4 血清炎症因子的检测 采集患儿入院第二天清晨空腹血液，分离血清，IL-6、PCT采用ELISA法测定，hs-CRP采用免疫比浊法测定，BECKMAN CUNLTER GENS 全自动无分类血细胞分析仪检测白细胞总数、丹麦全自动血沉仪检测血沉。

三、统计学分析

结 果

一、肺炎支原体阳性率、药敏试验及测序结果

经过检测显示，110例研究组中MP阳性感染患儿42例，阳性率38.18%。42例红霉素、罗红霉素、阿奇霉素、克拉霉素、加替沙星的敏感性及耐药性分析(见表1)。42例MP阳性中27例阿奇霉素敏感，15例耐药。阿奇霉素耐药15例患儿中，1年内阿奇霉素不规律使用2次的有2例，3次的有4例，4次的有9例，随着不规律用药次数的增加，耐药比例显著增加(P<0.05)(见表2)。

表1 42例MP阳性感染患儿的耐药性分析 [n(%)]

表2 1年内不规律阿奇霉素用药次数及耐药率分析 [n(%)]

二、治疗效果及预后恢复情况的比较

根据MP耐药情况将患儿分为耐药组(27例)和敏感组(15例)，其中耐药组治疗2周后治愈率为59.26%(17/27)；4周后治愈率为77.78%(21/27)；敏感组治疗2周后治愈率为100%(15/15)；耐药组发热时间、住院时间均高于敏感组(P<0.05)(见表3)。

表3 治疗效果比较

三、各组MP-DNA拷贝量的比较

两组MP-DNA拷贝量比较显示，耐药组MP-DNA水平显著高于敏感组，差异具有统计学意义(P<0.05)(见表4)。

表4 MP-DNA拷贝量比较

四、各组炎症因子的比较

各组炎症因子比较显示，耐药组血清hs-CRP、IL-6水平显著高于敏感组，白细胞总数、PCT、血沉与敏感组比较无显著差异(P<0.05)(见表5)。

表5 各组炎症因子及恢复情况的比较

五、Logistic回归分析影响耐药肺炎支原体感染患者预后的危险因素

单因素分析发现，MP-DNA、hs-CRP、IL-6是影响耐药肺炎支原体感染患者预后的危险因子(P<0.05)。多因素分析发现，MP-DNA、hs-CRP是影响耐药肺炎支原体感染患者不良预后的独立危险因素(P<0.05)(见表6)。

表6 Logistic多因素回归分析影响患者预后的危险因素

讨 论

MP感染是临床常见的儿童疾病之一，MP感染引起人肺A549上皮细胞黏蛋白表达增加，引起患儿痰液黏稠，气道内黏液分泌物明显增多、壅塞，常表现为大叶性肺炎[6]。MP感染除引起肺部症状外，还引起肺外多系统并发症，包括胃肠道反应、过敏反应等，部分患儿甚至出现多器官功能障碍或衰竭[7]。MP因为缺乏细胞壁，天然耐药头孢类抗生素、青霉素，但对四环素类、喹诺酮类、大环内酯药物敏感，儿童处于生长发育、骨骼形成阶段，限制四环素类、喹诺酮类药物在儿童中的应用，所以治疗儿童MP常用大环内酯类药物[8]。阿奇霉素是大环内酯类的一种，主要发挥抑菌、抗炎等作用，其组织渗透性较好，对肺部感染组织的治疗较好，临床常用阿奇霉素序贯法治疗儿童MP[9]。目前数据显示，我国儿童及成年患者中分离的MP菌株对大环内酯类具有较高耐药性，因此研究耐药MP患儿对临床治疗及预后具有重要意义。

赵熙婷等研究报道，阿奇霉素序贯法对耐药性MP治疗效果良好[10]。本研究中采用阿奇霉素序贯法治疗2周后，多数患儿痊愈，与上述报道结果相似，提示阿奇霉素序贯法治疗可用于儿童MP感染。王亚坤等研究报道，耐药MP患儿的治疗时间及病程均有所延长[11]。刘会彩等研究报道，大环内酯类治疗耐药MP退热时间较敏感株延长，总发热时间较敏感株也延长[12]。本研究显示，耐药组治愈率低于敏感组，耐药组治疗时间和退热时间均显著高于敏感组，提示耐药MP可对治疗效果及临床预后具有一定影响，与上述研究结果一致。

MP通过免疫学机制产生致病作用，MP感染机体后引起抗原抗体结合，激活补体，产生中性粒细胞趋化因子，大量白细胞聚集在病变部位，引起组织增生或者破坏性病变[13]。CRP是典型的急性期时相蛋白，是介导炎症反应的重要炎症因子，并且通过与炎症损伤细胞暴露的磷脂结合启动免疫应答[14]。PCT是甲状腺分泌的降钙素前体物质，机体正常状态下只存在少量，但当机体感染时PCT水平则会显著升高[15]。研究显示PCT与细菌感染程度呈正相关。IL-6是MP反应中的重要炎症因子，在细胞免疫和体液免疫中发挥重要作用，研究显示，IL-6在炎症反应早期异常增高，诱导T细胞分化，促进炎症因子的分泌，IL-6水平可能与MP感染的严重程度和临床预后相关[16]。本研究中耐药组患儿血清hs-CRP、IL-6水平显著高于对照组，白细胞数、PCT也高于对照组，与上述研究结果一致，炎性因子水平的升高可能与耐药MP表面的基因型变化，免疫损伤和炎症反应持续时间延长相关。

MP-DNA拷贝量客观反映了MP与宿主免疫清除能力之间的平衡。研究报道，MP核糖体23S r RNA V区2063位基因型的改变，引起敏感株的增殖受到抑制，而耐药株的增殖不受抑制，进而引起感染患者MP-DNA拷贝量的差异；且MP核糖体23S r RNA V区2063位基因型改变引起抗生素与核糖体亲和力改变[4]。本研究中耐药菌组患儿MP-DNA拷贝量显著高于敏感组，且耐药株2周治愈率低于敏感组，治疗时间高于敏感组，这可能与敏感组MP增殖力减弱、抗生素亲和力降低有关。COX多因素回归分析显示，MP-DNA、hs-CRP是影响耐药肺炎支原体感染患者不良预后的独立危险因素，提示可根据患者MP-DNA拷贝量、hs-CRP水平采取合适的治疗方法进一步改善患者预后情况。

综上所述，耐药组患儿MP-DNA拷贝量高于敏感组MP-DNA拷贝量，且是影响临床预后的独立危险因素之一。但关于耐药MP-DNA拷贝量与临床预后的具体作用机制有待进一步研究。