氧甾醇在肺部疾病中的作用及研究进展

楚师成 高学军 薛宝函 宋云浩 吴天宇

氧甾醇是胆固醇的氧化衍生物，由细胞色素P450家族酶介导的酶促反应或涉及活性氧和氮类物质的非酶反应生成。氧化反应促进羟基、酮基、高氧基、羰基或环氧基添加到胆固醇主干上，主要是在侧链的C4-C7位、C24、C25和C27位[1]。这一过程产生了一大类不同的氧甾醇，可以在正常的细胞过程中发挥着多种调节作用，如胆固醇稳态，也可以参与多种病理生理过程，如炎性疾病、动脉粥样硬化、神经疾病和癌症。研究发现[2]，相同的氧甾醇对不同的细胞系具有不同的作用，而相同的细胞系对不同的氧甾醇反应也不同。现就氧甾醇在不同肺部疾病中的作用进行综述。

氧甾醇对免疫反应的影响

先天淋巴细胞(Innate lymphoid cells, ILCs)是一种淋巴来源的免疫细胞，能对组织内稳态的破坏迅速做出反应。ILCs的器官分布不同，其主要存在于过多暴露在环境中的黏膜组织(如肠、肺)[3]。在稳态组织和炎症组织中ILCs的丰度也不尽相同[4]，哮喘患者的肺泡腔中存在产生IL-17的ILC3s。同样，患有特发性肺纤维化的人的支气管肺泡灌洗液中ILC2s含量增加。而在同一器官或组织中，ILCs的分布也有差异[5]。例如，ILC2s在肺内靠近间质细胞的血管周围有明显的聚集性。ILCs的这种分布差异可能与它们的迁移行为有关。GPR183-氧甾醇途径在控制炎症组织中ILCs迁移方面起着重要作用[6]。GPR183可以识别胆固醇的羟化代谢产物，即氧甾醇，其中7α,25-二羟基胆固醇(7α,25-dihydroxycholesterol,7α,25-OHC)是GPR183的主要配体。Tim等[7]证明了通过GPR183-氧甾醇途径可以使ILC3s定位于炎性结肠部位，这对于结肠淋巴组织的形成至关重要。类似地，ILC2s可以定位于肺的炎性部位减轻病毒对肺的损伤。由此可以合理地假设，组织损伤引起的氧甾醇合成，增加向免疫系统传递组织稳态的扰动，启动ILCs运动和炎症反应。

氧甾醇与哮喘

哮喘被认为是由于免疫稳态失衡所致[8]，而免疫稳态的恢复可以通过IL-10的表达来定义，IL-10是一种典型的抗炎细胞因子，可以协调终止免疫反应[9]，缺乏这个调控检查点可能会导致持续的炎症反应。因此有学者认为IL-10在哮喘发生中起着重要作用[10]，它可以通过抑制肥大细胞分泌IL-13减少杯状细胞增生以及减少嗜酸性粒细胞的产生控制哮喘发作。

研究表明，胆固醇生物合成途径(cholesterol biosynthesis pathway,CBP)可以产生氧甾醇，如7-酮胆固醇(7-ketocholesterol,7-keto)，其参与了调节性T细胞中IL-10的基因表达[11]。 Esperanza等[12]通过免疫印记分析(Ingenuity pathway analysis,IPA)提出胆固醇生物合成相关的多条路径与IL-10表达显著相关；IPA还显示，IL-10前体群表达的CBP基因与IFN-γ+IL-10+双阳性群体中IL-10蛋白水平呈负相关，提示可能需要活跃的胆固醇生物合成来许可Th1细胞表达IL-10。而与IL-10-人群相比，IL-10+的人群具有更高水平的CBP相关基因。由此可以看出，Th1转换为IL-10表达与CBP有直接联系，也为哮喘的控制提供了新的治疗思路。

氧甾醇与慢性阻塞性肺疾病

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是全世界慢性死亡和发病的主要原因，其治疗选择有限，特点是由于长期暴露于有毒气体和颗粒物，特别是香烟烟雾(Cigarette Smoke,CS)中，导致渐进性且不可逆的气流受限[13]。越来越多的证据支持诱导性支气管相关淋巴组织(inducible bronchus-associated lymphoid tissue,iBALT)在COPD发展中发挥关键作用[14-15]。iBALT是一种三级淋巴器官，主要位于支气管上皮旁，具有抗病毒感染的能力。然而，它们可能对COPD等慢性炎症产生不利影响[16]。胆固醇的氧甾醇代谢最近已成为调节次级淋巴组织结构和功能的中心途径[17]。

iBALT的大小和数量与患者COPD的严重程度相关[14]，胆固醇25-羟化酶(cholesterol 25-hydroxylase,CH25H)和胆固醇25α7羟化酶(25-hydroxycholesterol-7α-hydroxylase,CYP7B1)共同参与7α,25-OHC的合成。Jie等[18]通过实验证明，在COPD患者和CS暴露的小鼠中，气道上皮细胞CH25H和CYP7B1的表达上调，调节了CS诱导的B细胞迁移和iBALT的形成，而CH25H缺乏的小鼠在慢性CS暴露后不在肺内产生iBALT，并对COPD的发生有保护作用。有趣的是，单独的促炎细胞因子TNF-α也能够诱导气道上皮细胞CH25H的表达增强，这表明除了CS暴露对气道上皮细胞的直接影响外，促炎环境也能够增强CH25H的表达。克霉唑通过抑制CYP7B1抑制7α,25-OHC的产生，不仅可以阻止iBALT的形成，而且能够破坏已建立的iBALT，并减弱CS诱导的实验性COPD。有学者观察到COPD患者的成纤维细胞和气道上皮细胞衰老明显加快[19]，他们发现COPD患者的气道中还存在由CYP7B1驱动合成的27-羟基胆固醇(27-hydroxycholesterol,27-OHC)，其水平是健康人的30～100倍，它可以通过PGE2-RNS途径加速成纤维细胞及气道上皮细胞的衰老。综上所述，这表明COPD存在治疗机会，特别是考虑到目前针对COPD的治疗方案并不能逆转肺气肿的进展，这为COPD的治疗提供了新的靶点。

氧甾醇与急性肺损伤

急性肺损伤(acute lung injury,ALI)具有相当高的死亡率，特点是难治性低氧血症、非心源性肺水肿、肺顺应性降低和弥漫性肺浸润，常导致呼吸衰竭。重症肺炎是它的主要原因，其治疗方法极其有限，目前尚无针对性的特效药物[20]。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是引起包括危及生命的肺炎在内的严重疾病的革兰氏阴性细菌的一种成分，LPS触发的免疫反应需要它与细胞表面的Toll样受体4(Toll‐like receptor 4，TLR4)辅助受体髓样分化蛋白2(myeloid differentiation protein -2， MD-2)结合。TLR4通过辅助蛋白的介导识别与MD-2相互作用的LPS的脂链，并与其形成LPS-TLR4-MD-2复合体，激活NF-κB的转录，导致IL-6、TNF-α和IL-8等促炎细胞因子的过度产生[21]。

最近的一项研究观察到[22]，25-羟基胆固醇(25-hydroxycholesterol,25HC)减少了IL-1β的产生和炎性小体的活性，从而促进了感染性休克的恢复，Ouyang等[23]通过实验得出25HC预处理可显著降低LPS诱导的IL-1β、IL-6、TNF-α、KC和MIP-2等促炎细胞因子和趋化因子的产生，验证了这一结果。他们通过荧光光谱进一步观察到，随着25HC浓度的增加，重组人MD-2(Recombinant human MD-2,rhMD-2)的荧光强度逐渐降低，表明25HC与MD-2具有较高的结合亲和力。利用AutoDock程序对25HC的结合预测表明，在最有利的条件下，它与MD-2的Tyr-102、Tyr-65、Ile-117和Leu-71残基接近，与Tyr-102残基形成氢键。总的来说，他们揭示了25HC的抗炎机制主要是通过与MD-2的疏水结构结合，阻止LPS与TLR4-MD-2复合物结合，从而削弱下游Akt/NF-κB信号通路的激活，抑制炎性细胞因子的诱导，这预示着MD-2有可能成为治疗LPS毒性作用的靶点，为ALI的治疗提供了新思路。

氧甾醇的促癌作用

除了在炎症和免疫反应中发挥作用外，氧甾醇还与肿瘤的侵袭和转移密切相关。羟基胆固醇可以通过肝X受体(liver X receptors,LXR)依赖途径抑制树突细胞的抗肿瘤效应[24]，也可以通过LXR非依赖途径招募大量具有致肿瘤作用的免疫细胞[25]。羟基胆固醇通过激活LXR显著促进乳腺癌的转移，但LXR的激活抑制黑色素瘤的转移[26]。25HC还可以通过影响巨噬细胞分泌IL-1β[22]，参与多种类型肿瘤的侵袭和转移[27]。根据这些发现推测氧甾醇可能参与了肺癌的侵袭和迁移。

为了验证这一猜想，Chen等[28]对肺腺癌(Lung adenocarcinoma,ADC)细胞(A549和NCL-H1975)和THP1来源的巨噬细胞单独或共同培养，通过在培养液中加入25HC形成对照，观察25HC在肺癌中的作用。实验发现25HC通过剂量依赖性抑制肺癌细胞的增殖，而为排除这种效应对实验结果的影响，他们选用微摩尔浓度(0.1 μM)的25HC用于之后的实验。通过实验得出25HC可以提高LXR及肿瘤细胞转移性蛋白Snail的表达，进而促进ADC细胞迁移和侵袭。在敲除LXR之后，25HC的这些效应则被阻断。他们发现在含有25HC的单培养中THP1来源的巨噬细胞分泌IL-1β水平略有下降，这与以前的结果一致[22]。而有趣的是，在含有25HC的共培养体系中，IL-1β水平显著升高，且IL-1β能模拟25HC促进ADC细胞迁移、侵袭以及上调Snail表达的效应，但对LXR的表达没有影响。在敲除LXR后其效应也没有明显改变。因此，25HC可以通过提高LXR表达及诱导IL-1β分泌以非LXR依赖的方式来促进ADC细胞的迁移和浸润，这为肺腺癌的治疗提供了新思路。

氧甾醇的抑癌作用

HH-GLI通路与肺癌等众多癌症发生、发展和转移密切相关[29]。虽然这一途径是由HH配体通过自分泌信号激活的，但它也可以启动肿瘤微环境中细胞的旁分泌。以旁分泌为桥梁，HH信号可以影响肿瘤微环境中的基质细胞，基质细胞反过来产生可能支持肿瘤生长和转移的因子。因此，这种共振串扰可以放大HH信号并促进肿瘤进展[30]。致病的HH-GLI通路激活可能发生在HH信号转导级联的多个水平，包括Ptch1、Smo和Sufu的突变，以及通过产生HH蛋白和自分泌旁分泌信号，对HH信号进行无调控的刺激[30]。直接的Smo拮抗剂已经被研究用来抑制异常的HH信号以干预肿瘤的形成。不过到目前为止，Smo拮抗剂在人类癌症的临床试验中几乎没有显示出疗效[31]。GLI转录因子是HH信号的效应因子，介导了HH-GLI途径激活的转录效应[32]。突变的KRAS和TGF-β信号都可以以不依赖于Smo的方式诱导GLI活性[33]。实验证据表明，GLI1与小细胞和非小细胞肺癌都有不可忽视的联系[34]。Kasai[35]认为GLI1可以被认为是Smo下游HH-GLI途径中的一个可用药的治疗靶点。因此，与Smo拮抗剂相比，直接靶向GLI可能是实现肺癌等其他癌症精准治疗的一种更有效的策略。

氧甾醇20α,22(R)-二羟基胆固醇(20α, 22(R)‐dihydroxycholesterol,Oxy16)，是类固醇激素生物合成中胆固醇的天然代谢物。Wang等[31]发现Oxy16可以阻断由胰腺癌细胞产生的HH蛋白激活的间质细胞中的HH信号。在荧光素酶报告实验中，发现Oxy16显著抑制了NIH3T3-E1成纤维细胞中过表达的GLI1的转录活性和Sufu-/-小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEF细胞)中内源性GLI的转录活性。因此，我们有理由认为Oxy16和具有相似或改进特性的类似物成为肺癌等恶性肿瘤的新的候选治疗药物。基于这种设想，他们又验证了Oxy16类似物Oxy186对HH-GLI通路的抑制作用[36]。他们发现Oxy186对配体诱导和非配体依赖的HH信号有强烈的抑制作用。在HH配体激活的NIH3T3-E1细胞中，Oxy186对GLI的抑制作用明显高于Oxy16，且优于Gant61和HPI-1(它们已被确定可以在Smo下游抑制HH-GLI的先导分子[37])。此外，Oxy186有效地抑制了Smo变构激活引起的HH信号，在Sufu-/-MEF细胞中，Oxy186显著抑制HH靶基因的表达和GLI的内源性活性。当在人类癌细胞中检测Oxy186时，他们观察到PANC-1、A549和H2030细胞中内源性GLI1的表达显著受到抑制，这与在这些细胞中检测到的Oxy186的抗增殖作用非常一致。因此，可以推测，氧甾醇，如Oxy186，可以通过调节肿瘤细胞中配体的产生和成纤维细胞中对配体的间质反应，在肿瘤微环境中产生协同抑制效应。同样的，他们发现Oxy210[38]也具有相似的作用。这为肺癌的治疗提供了新靶点。

综上所述，氧甾醇作为胆固醇的中间代谢产物，不仅参与了肺部炎性疾病的发展与转归，还对肺癌的发展有着不可忽视的作用。尤其是一些新靶点的发现，对肺部疾病的治疗有着积极的推动作用。但我们仍需进一步研究氧甾醇及其对肺部疾病的影响，以制定更好的预防和治疗策略。