基质金属蛋白酶参与非小细胞肺癌侵袭能力的调控作用的研究进展

吴伟东 古佳升 刘清峰

癌症已成为21世纪人类在医学领域面临的重大挑战之一，其中肺癌的发病数量的增加也成为肿瘤所致死亡的重要原因。有研究表明，肺癌相比于其他器官的恶性肿瘤，所造成的经济损失是最多的[1]，其中最为常见的类型是非小细胞肺癌(NSCLC)，这也促使我们更加的关注有关NSCLC发生、发展机制，并进行更深入的研究。由于肿瘤细胞能够产生蛋白酶对周围组织中的细胞外基质(ECM)有破坏作用，因此能够实现远处迁移及粘附，这也成为肺部恶性肿瘤常常不能被根治的重要原因。而基质金属蛋白酶(MMPs)在NSCLC的转移和发展中发挥着重要的作用，对其进行检测有助于评估患者的病情进展及预后是否有效，因此也成为广大学者们研究及争论的焦点。本文就MMPs参与NSCLC的发展，以及MMPs对诊断和治疗NSCLC的意义，结合中外相关文献进行了综述。

MMPs家族的分类

MMPs家族是依赖锌离子、钙离子等金属离子作为其辅助因子的一大类蛋白酶，目前已经发现至少26种不同类型的成员，根据其作用底物的不同可将其分为5个大类，分别为间质胶原酶类、明胶酶类、基质分解素类、模性金属蛋白酶类和其他酶类，他们各自在破坏ECM中降解特定的胶原。由于MMPs在组织重塑和器官发育过程中发挥重要作用，MMPs家族的表达异常与从自身免疫性疾病到癌症等多种疾病有关。虽然在正常组织中也可以观察到低水平的MMPs的表达，但相关的组织在致病条件下的细胞修复、伤口愈合或组织重塑过程中受到干扰时MMPs的表达明显上调，这对于我们研究机体是否处于致病条件下也有重要的指示作用。

NSCLC中MMPs的调控

一、基因多态性相关

近年来有研究表明MMPs家族中某些成员的基因多态性与多种恶性肿瘤有关[2]，然而与肺癌之间的关系还没有明确的结论，这也表明科学界对MMPs家族多态性基因与NSCLC的关系的研究有迫切需求。Wen Li等[3]通过观察24名未经过放疗和化疗的肺癌患者和258名对照者发现，在MMP 9-1562C/T中携带C等位基因的患者有较高的患NSCLC肺癌风险，而携带T等位基因的人患癌的风险较低，并且NSCLC患者中CC基因型的频率与对照组相比明显增高。由此得出部分结论，CC基因型的MMP9-1562C/T与中国南方人群中NSCLC风险的增加有关。但研究也显示MMP-9的基因多态性与NSCLC在组织学类型、临床分期、淋巴结转移参数等方面差异无显着性，并不能用于对患者的相关评估。

多种MMPs相关基因的多态性被证明明显影响NSCLC侵袭性，但MMP1-1607 1G/2G的争议不断，有相关研究表明[4]在我国台湾省的肺癌人群中，针对显性和隐性模型的携带者比较结果支持1G/2G似乎不是肺癌决定性的等位基因生物标记物的结果。而在更大范围及更多患者数量的Meta分析认为MMP1-1607 (1G>2G)的多态性与亚洲人的肺癌风险之间存在关联[5]。这说明需要更多的基础研究及更大的统计学数据来确定MMP1-1607在NSCLC中的确切作用。

在经过对350例不能手术的NSCLC患者的总体生存期(OS)和无进展生存期(PFS)观察，Dorota Butkiewicz等发现[6]，MMP-2-1306、COX-2-1195和VEGFR2-906三种基因变异体的表达会明显缩短不能手术的NSCLC患者OS和PFS。进一步研究还发现MMP-2在单因素和多因素分析中，CT基因型和TT基因型携带者的PFS明显短于CC纯合子基因型。这可能意味着C等位基因携带者中MMP-2水平较高，且癌症进展的风险增加。应该强调的是，作者自己认为研究的适中样本量和研究变体的数据较少，在很大程度上限制了对结果进行进一步的验证。而在Bchir S等[7]的实验中表明，携带MMP-2-1306 CC基因型患者与血清中MMP-2水平和活性的改变有关，这与Dorota Butkiewicz等的结果一致。

而经过大样本的统计分析后也分别证实了MMP9-1562 C/T (OR=2.73,95%CI:1.74～4.27)、MMP2-1306 C/T(OR=0.49,95%CI:0.42～0.57)和MMP1-1607 1G/2G(OR=1.41，95%CI:1.21～1.65)在亚洲人群中的风险显著增加[8]。MMPs基因多态性的相关研究提示了我们，对MMP9-1562、MMP1-1607和MMP2-1306基因型的联合检测可能成为诊断NSCLC的一种新的潜在方法，而基因多态性对NSCLC的发展有密切的相关性。

二、微环境相关

近年来越来越多与NSCLC侵袭性相关的标志物被发现，虽然其中很多标志物都是由相关的炎症细胞或成纤维细胞产生，但可以获取的信息仍然有限。基于对微环境的研究Junichi Murakami MD等[9]提出：肿瘤内微环境与瘤外微环境之间的生物学联系将有助于解释肺气肿肺组织中的肺癌与肿瘤预后不良的有关原因。由于肺气肿发展中的主要原因是MMPs和/或抗MMP相关产物的失衡，而肿瘤内基质细胞中MMPs的过度表达也提示与NSCLC的不良预后相关。作者通过比较了I期NSCLC患者肿瘤内微环境中MMPs的表达状态及肺气肿的发病情况后发现，肿瘤内MMP-9的强表达与肺气肿发病频繁、瘤内淋巴管侵袭率高和肿瘤增殖活性强，有较高相关性，这有助于解释肺气肿肺组织中的肺癌与预后不良有关的原因。通过这个研究我们可以考虑，利用定量CT诊断肺气肿可能有助于NSCLC的筛查，并且预防肺气肿可能有助于减少难治性和侵袭性肺癌的发病率。而对于微环境相关因素影响肿瘤细胞侵袭性的相关研究还在其他恶性肿瘤细胞中也有存在，包括白介素在内的多种物质均可以影响其生长与代谢[10]，所以阻断微环境中相关的通路也可以为影响MMPs表达或癌症发展提供思路，现就NSCLC细胞微环境中白细胞介素及转化生长因子的相关研究做进一步综述。

1 白介素：肿瘤细胞的生长及发展所处微环境主要由浸润的白细胞、内皮细胞和肿瘤细胞自身共同调控。白细胞介素作为白细胞分泌的一类细胞因子，会在细胞受到损伤时释放，而针对白介素相关检测能更早的提示我们机体的相应病理变化过程。在Yi Na Jiang等[11]的既往研究中发现毛细血管扩张性共济失调症突变蛋白抗原(ATM)和白细胞介素6(IL-6)与肺癌肿瘤化疗引起的多药耐药有明显的相关性。观察发现ATM/p65抑制剂处理后的肺癌细胞在蛋白层面上消除了IL-6对MMPs表达的促进作用，同时也降低了与MMPs表达相关的高IL-6水平，而ATM/p65的沉默，则直接消除了IL-6在mRNA水平上对MMPs表达的影响。进一步研究了MMPs在IL-6促进肺癌转移中的作用[12]，研究通过观察几种不同肿瘤细胞中IL-6的表达水平后发现，NSCLC细胞中的IL-6水平相对较高。且与较高的IL-6水平一致的是，细胞中观察到更多的肿瘤细胞转移。而予以相应的MMPs抑制剂后发现IL-6对肺癌细胞迁移的速率也明显抑制。人为的增添IL-6后发现不仅MMPs在蛋白水平的表达提高了，而且在mRNA水平也增加了表达。所以可以认为IL-6诱导MMPs的表达，从而增强细胞迁移能力并促进肺癌转移，提示IL-6是抑制相关肺癌转移的潜在靶点。虽然也有其他研究表示IL-8可以经过介导 c-Jun、Ets-1等通路来调控MMPs的表达，促进了胃癌细胞侵袭能力[13]。但在Yi Na Jiang等的研究肺癌细胞中的IL-8水平没有发现显著差异性。

2 转化生长因子：肿瘤细胞微环境中的成纤维细胞被肿瘤细胞产生的可溶性因子极大地影响，其中分泌的转化生长因子-β(TGF-β)可以通过旁分泌的方式刺激成纤维细胞和内皮细胞的分化和增殖。因此TGF-β的过度表达是多种癌症的标志并与多种致癌事件有关[14]。

为了进一步了解肿瘤源性TGF-β1在肿瘤细胞微环境中的作用，Lakisha D. Moore-Smith等[10]的研究结果表明，在裸鼠肺部移植的肿瘤细胞中，TGF-β1、MMP-2和-9基因表达显著增加。以正常成纤维细胞与癌症相关成纤维细胞(CAFs)作对比时，TGF-β和MMP-2在CAFs中的表达均显著升高，而MMP-9的表达水平较低，但MMP-9随着肿瘤细胞晚期转移时显著升高。这些数据表明尤其是来自肿瘤细胞信号促进了TGF-β1对MMP-9启动作用。而MMP-9低表达时伴随的MMP-2的高表达可能与肿瘤细胞维持微环境中MMPs高水平的代偿性增高有关。研究结果还表明，MMP-9可以介导正反馈机制，因为它能够通过剪切潜在TGF的非活性部分而激活TGF-β。一旦被激活，TGF-β也可以向周围的成纤维细胞发出信号以增加MMP-9的表达。

Dong ming Wu等[15]提出了TGF-β介导的长链非编码RNA(LncRNA)调节肺癌细胞的迁移和侵袭，其中代表肿瘤细胞侵袭性的重要指标就是MMP-2所代表的MMPs一大类酶[16]。Dong ming Wu等利用TGF-β预处理A549细胞，发现肿瘤细胞的迁移和侵袭能力显著增加，并增加了血管内皮细胞通透性和下调内皮细胞的紧密性。通过qRT-PCR证实了TGF-β介导的外泌体中含有高水平的lnc-mmp2-2，表明了位于MMP2基因上游的lnc-MMP2-2结合位点的存在和作为转录增强子的潜在作用。在本研究中，外源性过表达和干扰实验表明，TGF-β调控lnc-MMP2-2表达而间接促进肺癌细胞侵袭能力和增加血管通透性。此外，肺癌进展过程中lnc-MMP2-2水平也与MMP2水平呈正相关。同样是LncRNA的BX357664基因被观察到在低表达患者的肿瘤分期较差，淋巴结转移或远处转移发生率较高，总生存率较低[17]。其中重要机制是影响NSCLC患者预后的关键蛋白(包括TGF-β1、p-β2、p-Smad3、N-cad、波形蛋白和MMP-9)明显减少。由此可以认为LncRNA BX357664基因作为一种保护因素，通过抑制包括TGF-β在内的多条途径抑制MMPs的表达而减少肿瘤细胞的转移。同时针对抑制TGF-β的表达而治疗肺癌的多种药物正在不同的试验阶段，其中包括化合物67(一种查尔酮类似物)和钒在内的多种治疗方式均证明有一定的疗效[18-19]。

三、 血管生成拟态

MMPs家族中的明胶酶类(包括MMP-2、MMP-9)充当着的分解ECM中层粘连蛋白的重要作用，而高侵袭性肿瘤细胞可以重新排列周围组织中层粘连蛋白，同时促进形成丰富的毛细血管。相关研究证明[20]，在没有明显血管增生的情况下，恶性肿瘤能通过形成毛细血管样管状网络增加侵袭能力。通过引入血管生成拟态(VM)的概念(被指高度侵袭性的肿瘤细胞在没有血管内皮细胞参与的情况下形成毛细血管样管状网络的能力)，Yanlei Li等[21]观察NSCLC中的大细胞肺癌(LCLC)发现，有VM形成的恶性肿瘤中层粘连蛋白5γ2和MMPs的表达水平明显增加。而出乎意料的是，实验通过离体实验证实了MMP-13可以切割降解层粘连蛋白5(Ln-5)并抑制上皮生长因子受体(EGFR)的活性从而干扰VM的形成，这与我们印象中MMPs对于肿瘤细胞生长和转移的促进正好相反。对于这样的实验结果患者也提出了相应的假设，MMP-13将Ln-5切割成了更小的Ln-5γ2′和Ln-5γ2x片段，正是因为这种能力阻止了EGFR分子信号进入细胞，并影响侵袭性肿瘤细胞的血管生成能力，而MMP-2能观察到对于VM生成的促进作用。由此可以看出针对MMP-13的具体作用仍然需要进一步的研究，鉴于MMP-13特异性的抑制剂已经被开发出来，相关研究可以为这种抑制剂的使用提供更多的依据，同时也为进一步针对NSCLC的治疗提供了新的解决途径。

而就影响VM形成的机制，有相关研究提出了Prdx1可能通过P38MAPK信号通路对VM的形成有促进作用[22]。通过体内、体外两个层面上的比较均发现，NSCLC细胞中Prdx1可以影响包括VEGF在内的多种物质促进VM形成。而在姚伶俐[23]等的研究中观察到NSCLC组织中，与VM走形一致的出现一类较为特殊的坏死细胞，主要表现为排列成线状、细胞胞体缩小、染色质高度凝集，并将这种类型的细胞死亡命名为“线形程序性坏死”(LPPCN)。研究在NSCLC中观察到LPPCN形成后可继发形成VM，促使血液流入缺氧状态的肿瘤组织中。DKK1作为Wnt信号转导通路的重要中间分子，促进NSCLC细胞中LPPCN和VM形成，其的机制与DKK1表达的上调所引起包括VM调控分子、β-catenin和Twist1表达有关，最终使细胞外基质重塑及MMPs的表达并且促进VM形成。

四、Livin

凋亡抑制蛋白(Livin)是最近发现的凋亡蛋白家族的抑制因子之一，已发现在多种癌症中过度表达，促进多种癌症的进展同时降低肿瘤对化疗和放疗的敏感性，但是其促进转移的机制尚不明确。且越来越多的研究表明[24]，Livin在细胞生物学中具有双重作用，其可以在各种刺激的诱导下抑制细胞凋亡；而在强烈的凋亡刺激信号下，Livin会特异性的被半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶所切割，产生截短的蛋白质，这种截短的蛋白质反而会增加死亡率。

Xian Lin等[25]根据相关既往研究认为Livin、VEGF和MMPs之间存在信号反馈环，并且Livin的敲除可以触发的VEGF和MMPs的协同抑制，最终可以抑制肿瘤细胞的转移。而在史芳涛等[26]的研究中进一步证明了Livin蛋白对比NSCLC、良性病变和正常组织中，在肺癌组织中的高表达，同时也观测到CXCR4、MMP-2、MMP-9 表达的增高。不仅如此，研究也发现Livinα和Livinβ呈正相关的同时，Livinα在NSCLC化疗患者中的表达更有意义；肿瘤在左侧肺部时Livinβ的表达水平更高。

MMPs对NSCLC的诊断意义

在最初MMPs被认为只与ECM结构的裂解有关，但是通过它们对其他非ECM底物(包括对生长因子和受体，细胞因子，趋化因子和细胞粘附分子)作用观察发现，MMPs参与调节癌症多种重要生理过程，如细胞生长，凋亡，肿瘤血管生成和逃避免疫监视功能。然而即使进行了越来越多针对MMPs的研究，其对恶性肿瘤的诊断价值仍然知之甚少。Sonia Blanco-Prieto等[27]通过在NSCLC患者及正常组织中比较MMPs家族成员中MMP-1、-7和-9，评估这些MMPs在NSCLC患者中的诊断价值。研究结果发现MMP-1虽然在NSCLC中有高表达，但与对照组相比这种差异没有统计学意义，其对肿瘤的特异性较低(AUC：0.538)。这符合既往研究发现特发性肺纤维化(IPF)中MMP-1的高表达，甚至也有学者提出其作为IPF的诊断标记物[28]。但MMP-1在NSCLC患者III和IV期观察到相当高的水平，发现其血浆水平升高和组织中的表达上调与低生存率有关，这些结果提示MMP-1可能参与了肿瘤的晚期过程。尽管发现MMP-7具有中等的区分NSCLC的能力，但在良性和健康对照组中也显示显著增加(AUC：0.64)。相关研究也表明[29]，尽管其在NSCLC中的水平明显高于其他肺部疾病(慢性阻塞性肺病、哮喘等)和正常组织，但仅与间质性肺炎的水平相似。相比于另外两个家族成员，MMP-9在比较健康对照组和恶性肿瘤患者中观察到显著升高，为NSCLC提供了最佳的诊断能力(AUC：0.739)，这与报道NSCLC患者血清中MMP-9水平显著高于非恶性肺部疾病或健康对照组的其他研究相一致[30]，并且Zhang Y等通过实验得到了更佳的数据证明MMP-9用以区分NSCLC与非肿瘤患者(AUC:0.882)。相关研究[31-33]也证明了MMP-9在肺癌诊断中的价值，同时发现包括碱性成纤维细胞生长因子、VEGF和基质金属蛋白酶抑制因子-1也在肺癌组织中表达明显增高。基于这些证据，MMP-9将是提高NSCLC诊断准确性的合适候选者，研制以MMP-9为检测对象的相关初筛试剂或快速检验仪器，将有效的增加NSCLC的检出率，可以在肿瘤的更早期得到警示和得到更多的治疗机会。

抑制MMPs相关药物用于治疗及预后

MMPs的表达对于肿瘤转移表现出较强的相关性，但以此为靶点的相关药物研究却仍然有待于继续发展，虽然已有针对抑制MMPs的相关治疗药物相继进入临床试验阶段(如一代MMPs合成抑制剂巴马司他、二代药物马马司他等)，但均由于水溶性较差或属于广谱抑制剂，表现出较为明显或严重的不良反应而被暂停相关试验。这给我们提出了从理论转化为技术或成果的巨大挑战，如何从既有的实验结论中获取真实可行的治疗和预后方式成为针对恶性肿瘤治疗的又一个难点。随着科技水平的不断进步，仍有针对抑制MMPs相关新的药物推陈出新，开始经受动物及临床实验的考验。

一、Pipoxolan

由Pailer等合成的Pipoxolan(哌泊沙仑)在许多国家已被广泛当作平滑肌松弛剂而用于抗平滑肌痉挛或治疗偏头痛，而近年来其发现有明显的抗癌活性而被用于相关肿瘤的治疗[34]。为研究Pipoxolan对肿瘤细胞的抑制作用是否也可作用于抑制肺癌的进展或转移，Min Min Lee等研究了Pipoxolan作用于肺腺癌细胞后，其抑制转移作用及潜在的分子机制[35]。研究发现Pipoxolan在处理具有高侵袭能力肺腺癌细胞后，其显着抑制了MMP-2和MMP-9的活性和相关蛋白表达，且细胞增殖率、细胞的迁移和侵袭能力明显受到抑制。研究认为，当受到各种细胞外刺激时，p38可以被激活并作用于其下游靶点，其中包括MMP-2和-9。同期也有相关研究表明[13]， 肿瘤细胞中IL-8受体通过参与Ets-1、c-Jun的表达通路而异常调控MMP-9的表达，从而促进肿瘤细胞的发生、发展和侵袭能力，这也从侧面证实了Pipoxolan能够有效地通过抑制p38MAPK和JNK1/2的磷酸化来抑制MMPs的表达，从而调控肺癌细胞转移能力。然而作者文中也表示，Pipoxolan对具有高度侵袭性肿瘤细胞的抑制作用还需要在活体动物或临床研究中进行进一步观测，以验证其在临床应用中抑制肺癌细胞转移能力的作用。

二、多西环素

多西环素是临床上广泛使用的四环素类抗生素家族的一员，越来越多的证据表明多西环素对包括黑色素瘤和前列腺癌在内多种恶性肿瘤具有抗肿瘤活性[36-37]。这种耐受性良好的抗生素也可能对其他人类癌症有效，是一种具有重大研究价值的候选抗肿瘤药物。SHENG-QI WANG等[38]通过在肺癌细胞中分组使用不同浓度的多西环素，并定时检测肿瘤细胞的细胞毒作用。经过对比观察到其以时间和浓度依赖的方式抑制肺癌细胞的增殖能力和集落形成能力。并与以5-氟脲嘧啶为代表的对照组进行比较后发现多西环素处理后的肺癌细胞增殖的抑制作用更强，同时显著降低肺癌细胞MMP-2，MMP-9和VEGF的分泌，而增加TIMP-2的分泌，并且与对照组相比多西环素组的肺癌细胞凋亡比例显着增加。相较于5-氟脲嘧啶其副作用更少且更易耐受，对药物的耐药性也相对较好。MMPs所代表肿瘤细胞的转移能力在实验中也得到了显著的抑制，其原因是四环素类抗生素家族的成员是有效的MMPs抑制剂，并且可能能够从MMPs的活性位点螯合锌离子。此外，多西霉素还通过抑制基底膜的降解以及血管生成来抑制肺癌细胞的迁移和侵袭，这些发现进一步表明多西霉素作为新的治疗肺部恶性肿瘤的潜力。Qin Y等[39]还发现多西环素具有逆转上皮向间充质的转化的能力，其主要途径是多西环素可抑制转录因子SNAI1/2、Twist1/2、NF-κB、AP1和STAT3的活性，从而抑制信号转导，逆转上皮向间充质的转化，最终抑制肿瘤的生长和转移。相关研究[40]也证明了多西环素能够有效抑制NF-κB通路，进而抑制p52，使肿瘤细胞的生长和进展受限。这为我们提供治疗肿瘤新靶点的同时也证明了多西环素在体外实验中对肿瘤细胞的抑制作用。

三、双硫仑

双硫仑是一种磺胺类化合物, 一般用于治疗酒精中毒，由于其对金属Cu具有很强的螯合金属能力,所以也有一定的抗肿瘤活性。但是其在血液中代谢速率很快(4 min)，这一问题限制了双硫仑在临床上的抗癌应用。已有前期研究证明[41]双硫仑能够抑制肿瘤的转移和侵袭, 其主要原因是通过抑制MMP-2和MMP-9的表达。最近的一项IIb期研究表明[42]，双硫仑联合顺铂和长春瑞滨耐受性良好，并且相比于传统化疗延长了新发NSCLC患者的生存期。在Mohammad Najlah等的研究中[43]，将双硫仑包裹在聚乳酸-乙醇酸纳米颗粒上，同时口服铜。研究结果显示，经过包裹后的双硫仑在血液中的半衰期从不到2 min延长到7 h，并且在释放双硫仑的同时对其本身的纳米粒子特性影响不大，能够稳定释放。通过对一种新的方法对现有抗癌药物的缺点进行改进，可以拓宽短效药物的使用范围。

结 语

随着近年来对MMPs家族的研究越来越深入，其已经成为评判恶性肿瘤转移能力的重要指标之一。通过对促进MMPs生成的相关靶点进行抑制，如今这样具有前瞻性的研究也成为了寻找治疗或抑制癌症的突破方向之一。然而如今大量针对抑制MMPs的特异性药物所带来的优势(相较于如今的化疗药物)也会随着更多和更加深入的研究证明它们的未来更加具有前景。