急性呼吸窘迫综合征的新希望-间充质干细胞

范新元 崔恩海

一、ARDS与MSCs概述

急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)是指急性肺损伤进展为急性呼吸衰竭的一个动态演变过程，可由多种致病因素引起，如肺炎、败血症、急性胰腺炎及重大创伤等，主要病理特征为急性弥漫性肺实质炎症及血管通透性增加，是危重疾病和累及生命的肺部疾病的常见并发症。针对ARDS，目前没有统一的且能被广泛应用的特效药物[1]，临床治疗以机械通气、液体管理、病因治疗及营养对症支持为主。据国外临床数据统计分析[2]，ARDS患病率占重症监护病房入住率的10%，而其死亡率在35%至46%。因此，迫切需要新的治疗方法逆转ARDS的疾病进程、改善ARDS患者的生存质量及降低死亡率。

干细胞(stem cells)是指原始且未充分分化的潜在功能细胞，可再生为各种组织器官，按照哺乳动物发育过程的先后，可分为胚胎干细胞(embryonic stem cells, ESCs)及成体干细胞(adult stem cells)。间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs) 又称为多能间充质基质细胞，是一种可以自我复制的非终末分化成体干细胞。近年来，MSCs在治疗炎症性肠病[3]、系统性红斑狼疮[4]等组织损伤性疾病中起重要作用，通过发挥免疫调节潜力，调控炎症等级作用，减缓疾病的进展，有动物试验模型及临床前期研究结果证实MSCs对ARDS的有效性，为ARDS的临床治疗提供了一个新希望。

二、MSCs的应用背景

MSCs的生物学特性有利于其在临床上的广泛应用。上世纪60年代末，Friedenstein从骨髓中提取到一种外形呈类纤维细胞的长梭形基质细胞，培养时易贴壁生长，且可于体外大量培养扩增，并命名为MSCs，后续研究发现其在炎症性肠病、系统性红斑狼疮等疾病治疗中展现了良好的应用前景。MSCs的良好应用前景取决于它的一系列特性：1)易提取：MSCs作为一种由胚胎早期中胚层细胞发育而来的成体干细胞，可存在于全身多个组织和器官中，如骨髓、脐带、胎盘、脂肪等；2)低免疫原性[5]：由于II型主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex II, MHC-II)及T细胞协同刺激分子(CD40、CD80、CD86等)不表达于MSCs表面，导致T细胞活化通路中的第二信号丧失，使得同种异体MSCs的移植手术无需配型；3)低致瘤作用[6]：MSCs从宿主组织中提取后即可在体外迅速增殖，但移植后在体内寿命短，因此致瘤作用比较低。4)易扩增培养：MSCs有能力分化为各种细胞，且易于扩增培养。研究发现[7-8]在无血清培养体系中应用组织块法分离培养MSCs可以有效降低成本，简化操作，提高细胞迁出率及消除有未确定的病原体引起的风险。由于MSCs缺乏特异性的细胞表面标志物，国际细胞治疗协会(ISCT)在2006年为定义MSCs制定了最低鉴定标准[9]：MSCs在组织培养基上应该紧密贴壁生长；在适当的体外条件下，MSCs有能力分化为各种细胞，如骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞等；MSCs细胞表面阳性表达CD73、CD90及CD105，阴性表达CD14/11b、CD34、CD45、CD79a/CD19及HLA-DR。

三、MSCs参与ARDS的可能机制

1.MSCs通过直接分化机制参与ARDS。在ARDS的疾病进程中，病理改变的关键是肺泡-毛细血管屏障受损，基于MSCs的多向分化潜能特点，最初研究时人们倾向于MSCs对ARDS的有效性在于MSCs可特异性归巢至肺损伤部位，直接分化为肺泡上皮细胞及血管内皮细胞，通过修复损伤肺组织，恢复肺部结构及肺功能。Zhang等研究发现[10]，MSCs通过过度表达p130或E2F4，从而调节细胞周期，尤其是G1相，可以促使MSCs转化成肺泡II型细胞，并改善ARDS小鼠上皮细胞的功能。而另一项试验中[11]，使用同等剂量的骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BM-MSCs)移植入烟雾介导的肺损伤裸鼠模型及健康对照组，研究发现肺损伤裸鼠模型中细胞信号虽强于健康对照组，但在7.5 h达到峰值后，随着时间推移信号逐渐减弱，且在第5 d的时候试验组的肺部细胞信号完全消失，该研究结果引起了很大争议，在如此短的时间内BM-MSCs是否能够分化成肺部受损细胞？不同来源的MSCs在不同致病因素的试验模型中结果是否与此相同？尽管现在的研究对分化机制产生了疑议，但我们依然不能完全排除分化机制可能。

2.MSCs通过旁分泌机制参与ARDS。ARDS是机体失控的全身样炎症反应的肺部体现，在ARDS的病程中，炎症细胞及其释放的炎症介质、细胞因子起关键作用[12]。随着对ARDS的研究认知不断发展，现在的主流观点认为MSCs可以直接分泌或促进一系列细胞因子及生长因子的产生，通过组织间隙作用于肺损伤部位，发挥多种生物学功能逆转ARDS的病理生理过程。(1)MSCs通过提高炎症部位抗炎因子的浓度，抑制促炎因子的释放，减轻炎症反应。有研究发现[13]，在呼吸机诱导成的小鼠肺损伤模型中应用MSCs，可减少肺泡中性粒细胞浸润，降低支气管肺泡灌洗液(BALF)中细胞因子诱导的中性粒细胞趋化因子-1(CINC-1)及白细胞介素-6(interleukin-6, IL-6)水平，减轻肺损伤及恢复肺结构。另一项研究中[14]，在通过大肠杆菌内毒素诱导成小鼠肺损伤模型中，使用MSCs可降低BALF及血浆中促炎因子的含量，如肿瘤坏死因子(TNF-α)及巨噬细胞炎症蛋白-2(macrophage inflammatory protein-2, MIP-2)，减轻炎症,同时又提高了抗炎因子IL-10(interleukin-10, IL-10)及IL-13(interleukin-13, IL-13)的释放，显著改善了小鼠的生存率，减轻肺损伤程度。(2)MSCs通过调节肺泡上皮-毛细血管内皮屏障的通透性减轻肺水肿，Fang[15]等发现MSCs可旁分泌血管紧张素-1(Ang-1)，能维持肺微血管内皮细胞完整性，降低肺泡Ⅱ型上皮细胞通透性，从而保护气血屏障。另一项研究中[16]，MSCs在肺组织中可以分泌“足够的”血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)，通过阻止已损伤的血管内皮细胞凋亡，维持气血屏障完整性，保护屏障。(3)MSCs通过增加肺泡液清除率(alveolar fluid clearance, AFC)减轻肺水肿，即正常肺泡上皮细胞通过Na+-K+-ATP酶、Na+通道及水通道蛋白清除肺泡内水肿液的过程，而各种致病因素可导致AFC降低，形成肺水肿。研究发现[17]，在流感病毒感染诱导的肺损伤模型中，MSCs通过增加角化细胞成长因子(keratinocyte growth factor, KGF)的分泌，阻止Na+-K+-ATP酶的下调及钠氯转运蛋白的受损增强肺泡液清除，减轻肺水肿。(4)MSCs通过直接清除肺部病原体治疗ARDS，造成ARDS的病因及危险因素很多，而微生物病原体的感染最常见，所以如何减少肺内病原体的数量是治疗ARDS的一个重点。有研究报道[18]，体外试验中予大肠杆菌预处理的MSCs条件培养基可以抑制细菌生长，同时MSCs分泌的抗菌肽LL-37明显增加，进一步完善体内试验，在大肠杆菌感染小鼠模型移植入MSCs及LL-37抑制剂处理后，肺内细菌清除能力则下降。最新研究发现[19]，MSCs通过toll样受体4信号通路表达的β-防御素(β-defensin, BD2)也是介导肺内细菌清除的重要旁分泌因子之一。(5)ARDS的后期病理变现为肺纤维化，研究发现[20]急性肺损伤时，MSCs可能通过改变金属蛋白酶-8(MMP-8)与组织抑制金属蛋白酶-1(TIMP-1)之间的平衡，促使巨噬细胞的表型从M1(抗炎和抗菌)转变到M2(创伤修复和炎症消退)，通过降低肺内胶原纤维含量，降低肺间质的纤维化程度。

3.MSCs通过释放微泡及传递线粒体参与ARDS。长期以来，对微泡的定义是作为一种物质载体存在于细胞的分泌外排过程中。随着研究发现[21]，不同组织来源的细胞分泌的微泡除了具有某些共性外，其功能与其来源的母细胞具有直接联系，MSCs来源的细胞微泡(microvesicles, MVs)主要通过其包含的micro-RNA，各种蛋白和线粒体发挥治疗作用。Monsel等[22]在大肠杆菌诱导的小鼠肺损伤模型中，同时移植人BM-MSCs来源的MVs和MSCs，两组小鼠的生存率及细菌清除能力均显著增加，肺损伤严重程度同样降低，表明MVs和MSC的治疗作用相似，也证实了MSC的部分功效源于携带基因物质的微泡。另一研究[23]发现线粒体可以被MSCs转运至巨噬细胞，能够增强其吞噬能力。在其他组织器官损伤修复模型中，线粒体传递被认为是一种细胞修复机制，这可能是MSCs治疗ARDS时抗菌减轻肺损伤的一个新机制。

四、优化MSCs疗效

目前已有两项完成的MSCs治疗ARDS患者的Ⅰ期临床研究[24-25]证实了MSCs治疗ARDS的安全性，但ARDS患者的预后并未明显改善。如何进一步提高MSCs的疗效是研究中的一个重点，有以下几种观点：1)通过选择最佳的MSCs的来源来提高MSCs的疗效。MSCs具有异质性，因此选择合适的供体时，需考虑年龄、性别、健康情况等因素。另外Philipp Mattar等发现[26]，同一供体不同来源的MSCs调控不同亚群免疫细胞的能力有些许差异，且不同的体外培养环境导致了MSCs的免疫抑制能力也稍有不同，目前仍缺乏针对ARDS选择最合适的MSCs来源的研究。2)通过改变MSCs的培养环境增强MSCs的疗效。缺氧是ARDS肺损伤部位微环境的典型特征之一，通过影响炎症因子的含量改变MSCs的免疫调节功能。有研究显示[27]，低氧环境下培养的MSCs能够分泌更高水平的VEGF和单核细胞趋化蛋白(MCP-1)，可能是通过激活PI3K-Akt通路，抑制缺氧内皮细胞凋亡，增强免疫调节功能。3)通过选择最佳的注射方式及剂量增强MSCs的疗效，临床移植MSCs的方式主要有气道滴注、静脉及腹腔注射。研究对比发现[28, 13]，治疗ARDS时气道滴注及静脉给药较腹腔给药更能有效的促进动脉氧合的恢复，改善肺顺应性，虽然两项试验同时证明了MSCs移植治疗时剂量与疗效是非线性关系，但在MSCs的最佳疗效剂量上存在分歧，考虑是否与ARDS的致病因素相关，不同致病因素导致的ARDS在MSCs的最佳疗效剂量上可能存在差异，目前并没有统一研究证实存在最佳移植剂量。4)通过提高肺部MSCs归巢率提高疗效。归巢即自身或外源性的MSCs定向迁移至肺损伤部位并定植修复的过程，MSCs治疗ARDS的成功与否很大程度上依赖于是否有足够的MSCs归巢至肺损伤组织，而提高归巢率主要通过调节相关的趋化因子、黏附分子、生长因子及蛋白酶表达水平来实现。有研究发现，SDF-1-CXCR4轴被认为是关键性趋化因子，基质细胞衍生因子-1(SDF-1)是一种小型趋化因子，也称为CXC趋化因子配体12(CXCL12)，通过与其组织受体CXCR4结合调节MSCs的迁移过程。归巢过程中涉及的另一重要因素即黏附因子，MSCs通过表达异二聚体蛋白α4/β1整联蛋白，又称为晚期抗原4(VLA-4)，与内皮细胞上的VCAM-1结合实现跨内皮迁移[29]。

五、讨论

首先是MSCs的最佳来源问题。实验室制备MSCs组织来源广泛，但不同来源的MSCs在基因表达和遗传稳定、分泌蛋白组和细胞表面蛋白存在异质性，这可能影响其免疫调节作用。针对ARDS，MSCs的最佳来源并未形成统一定论，并且实验室制备MSCs的生产过程需要良好的监管控制，后期储存目前倾向于冷藏保存温度，临床输注前需检测细胞活性及无菌性，保证最佳输注时机，获得最佳疗效，另外需考虑运输时间长短及运输方式对细胞活性的影响。

其次是充分的临床前期研究。众多的动物模型及临床前期研究证实了MSCs治疗ARDS的可行性，但MSCs治疗ARDS作用机制复杂多变。目前发现的直接分化、旁分泌及微泡转运、线粒体传递均有涉及，尽管目前众多动物模型的侧重点在旁分泌机制，但直接分化及微泡、线粒体的研究仍不能停止，继续深入研究ARDS的发病机制，探索是否有新的修复损伤途径，通过增强主要作用机制提高MSCs的疗效。

MSCs的临床疗效有待验证。不同致病因素导致了ARDS的轻重程度不一，动物模型中评价MSCs的疗效可以通过BALF中炎性因子浓度、细菌计数、湿-干肺比率、MSCs标记物追踪以及肺组织病理切片等手段，但临床评估ARDS的严重程度时手段相对有限，主要依赖于氧合指数(OI)，即动脉血氧分压(PaO2)/吸入氧浓度(FiO2)的比值，临床MSCs治疗时可以通过定期监测OI的变化评估疗效，也需要同时结合临床症状、肺功能及影像学综合评估。

综上所述，ARDS病死率居高不下，但MSCs疗法成为治疗的一个新希望，通过MSCs治疗可逆转ARDS的疾病进程，改善ARDS患者的生存质量以及降低死亡率。尽管目前在临床转化应用前有一系列问题需要解决，但MSCs治疗ARDS的前景无需质疑。