联合检测血清和胸腔积液Crk样蛋白、CEA在恶性胸腔积液诊断中的价值

李文妹 尤青海 常远敏

2018年最新的全球肿瘤统计结果显示肺癌是全球发病率、致死率最高的癌症：无论是发病率(11.6%)还是死亡率(18.4%)均名列第一。虽然随着生物免疫制剂及分子靶向治疗的广泛应用，肺癌仍是一种预后极差的疾病，即便采用综合治疗，总体生存率仍未改变[1]。诊断与预后评估对于肺癌患者至关重要，在临床工作中诊断及预后评估是重点。肺癌引起的恶性胸腔积液是肿瘤晚期常见的并发症，约15%非小细胞肺癌伴有恶性胸腔积液，50%非小细胞肺癌最终转移至胸膜，发展为恶性胸腔积液[2-3]。恶性胸腔积液临床预后差，中位生存期仅为3～12个月[1]。虽然细胞学、胸腔镜等检查可以作为恶性胸腔积液的有效检测指标，但由于各自缺点，使得临床应用受限，而且胸腔积液细胞学的诊断率为50～70%[4]。因此，寻找灵敏度和特异性高的诊断方法对提高良恶性胸腔积液诊断率十分重要。近年来国内外学者都在试图寻找更有效的检测指标以提高恶性胸腔积液的检出率，肿瘤标志物就是其中的研究热点。Crk样蛋白(CRKL)是Crk(CT10激酶的调节因子)家族成员之一，在胃癌、肺癌等实体肿瘤中表达增加[5-6]，但目前未见胸腔积液中CRKL表达的报道，本实验通过检测胸腔积液中CRKL含量，评估其临床意义。

资料与方法

一、临床资料

收集2017年10月至 2019年3月在安徽医科大学第一附属医院住院的胸腔积液患者93例。其中实验组47例，包括腺癌38例，鳞癌6例，小细胞肺癌3例；其中男/女，35/12，年龄在39～85岁，平均年龄(64.55 ± 11.17)岁。对照组46例，包括肺部感染35例，结核5例，其他6例，男/女，28/18，年龄26～83岁，平均年龄(62.59 ± 14.55)岁。

二、研究方法

1 主要试剂 CRKL、CEA ELISA试剂盒，购自美国云克隆公司(CCC，USA)。

2 标本采集及指标检测 无菌采集两组患者清晨空腹静脉血3 mL，室温静止2 h后，1000 r·min-1，离心15 min。收集上层血清分装，- 80℃保存。留取胸腔积液10 mL，同血液血清离心分装保存。ELISA如下：①准备: 试剂盒室温复温30 min；②配液:将浓缩洗涤液用蒸馏水稀释成为原倍洗涤液；③加样: 分别设置空白对照孔、标准品孔及待检样品孔，空白对照孔不加样品；④温育: 37℃ 温育 30 min；⑤洗板；⑥加入酶标工作液；⑦温育:37℃ 温育30 min；⑧洗板；⑨显色；⑩终止: 每孔加入500μL 终止液，可见颜色由蓝立即转为黄色。以空白孔为调零孔，终止反应15 min内，于450 nm波长下检测各孔OD值。○11计算: 计算标准曲线直线回归方程，根据 OD 值计算样本浓度。

3 数据处理 各组临床资料比较采用SPSS 25.0软件，不满足正态分布的数据采用非参数统计分析，通过Mann-Whitney U-test确定两个独立组之间的差异。以恶性胸腔积液患者和良性胸腔积液患者的CRKL、CEA水平作为对照，构建受试者操作特征(ROC)曲线。选择的截止值是那些具有最高准确性的值，分别计算每个标记的特异性、敏感性和准确性，使用逻辑回归模型评估这两种联合肿瘤标志物在鉴别良恶性胸腔积液中的效用。

结 果

一、 两组患者血清及胸腔积液中CRKL及CEA比较 两组在性别、年龄等一般资料统计学差异不显著(P>0.05)(见表1a、b)；观察组胸腔积液中的血清及胸腔积液中的CRKL、CEA高于对照组，统计学差异显著(P<0.05)(见表2)。

表1a 两组胸腔积液患者性别比较

表1b 两组胸腔积液患者年龄比较

表2 两组患者血清和胸腔积液CRKL和CEA含量M(P25,P75)

二、 血清及胸腔积液中CRKL、CEA的诊断临界点及其诊断效能

血清及胸腔积液中CRKL最佳临界值分别为 2.04 ng/mL、3.04 ng/mL，灵敏度分别为80.9%、74.5%，特异性分别为80.4%、84.8%；血清及胸腔积液中CEA最佳临界值分别为8.4 ng/mL、15.29 ng/mL，灵敏度分别为66%、74.5%，特异性分别为91.3%、97.8%。联合检测血清及胸腔积液中CRKL的灵敏度为80.9%，特异性为80.4%；联合检测胸腔积液CRKL与CEA的灵敏度为89.4%，特异性为95.7%；联合检测胸腔积液及血清CEA的灵敏度为74.5%，特异性为95.7%；四者联合的灵敏度为87.2%，特异性为97.8%(见图1、表3)。

讨 论

CRKL作为一种癌基因，位于22q11.21扩增区域的中间，并且被确定为许多癌症中最常被扩增的区域之一，在多种癌症进展中有着重要作用，包括胰腺癌的细胞增殖和侵袭，肺癌的细胞侵袭和肝癌的增殖、迁移和侵袭[7-9]。近年来，研究发现CRKL可能为一些肿瘤的治疗靶点，如卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、肺癌、宫颈癌等[6,10-13]。CRKL与肺癌的关系是近年来研究的热点，CRKL可能通过促进cyclin D1和cyclin B1介导的细胞周期进展，促进肺癌细胞增殖，CRKL在NSCLC中的过表达与肿瘤分化、组织学类型、p-TNM分期、肿瘤细胞增殖、患者生存质量差有直接关系，鉴于这些发现认为CRKL可能是肺癌治疗的一个潜在治疗靶点[6]。研究证实CRKL与NSCLC中EML4-ALK突变致癌有关；CRKL的下调可阻断RAS和RAC1等ALK下游通路的激活，导致这些细胞的存活、运动和转化活性降低，提出间接抑制CRKL的活化可能是提高ALK-重排NSCLC患者ALK抑制剂疗效的有效策略[14]。另外发现，乳腺癌患者血清CRKL水平显著高于健康者，在晚期乳腺癌患者中，血清可溶CRKL较早期患者高[15]，从而推测CRKL可作为肺癌患者的肿瘤标志物。

图1 血清及胸腔积液中CRKL、CEA对恶性胸腔积液诊断价值的ROC曲线

表3 血清及胸腔积液中CRKL、CEA诊断诊断效能

本研究发现肺癌患者血清及胸腔积液中CRKL中位数分别为3.02 ng/mL、3.87ng/m，这与以往研究肺癌组织中CRKL较肺正常组织表达高相一致[6,8]。单独检测血清及胸腔积液中CRKL灵敏度分别为80.9%、74.5%，特异性分别为80.4%，84.8%。本研究表明血清CRKL灵敏度高于胸腔积液CRKL的灵敏度，胸腔积液CRKL特异性高于血清中CRKL的特异性，联合检测血清、胸腔积液CRKL灵敏度及特异性较单独检测胸腔积液CRKL的灵敏度增加。

本研究发现肺癌患者血清及胸腔积液中CEA中位数分别为8.4 ng/mL、15.29 ng/mL，灵敏度分别为66%、74.5%，特异性分别为91.3%、97.8%，联合检测胸腔积液及血清CEA的灵敏度为74.5%，特异性为95.7%，这与以往研究结果一致[16]。实验结果还提示单独检测CRKL水平灵敏度高于单独检测CEA的灵敏度，但特异性较单独检测CEA低。联合检测CRKL与CEA可明显提高灵敏度，四者联合检测灵敏度可达87.2%，明显高于单独检测CEA灵敏度。

综上所述，本研究发现在晚期肺恶性肿瘤患者的血清及胸腔积液中CRKL含量升高，CRKL可作为鉴定良恶性胸腔积液的重要辅助指标；胸腔积液CRKL联合胸腔积液CEA检测，可提高恶性胸腔积液的诊断价值。这些数据应该在未来的临床试验中得到进一步的验证。