浅谈病理科小活检标本制作方法

刘华斌

（山西省肿瘤医院病理科，山西 太原 030000）

随着科学技术的不断发展与进步，以及国家对医疗卫生事业的大力扶持与投入，医院病理科也迎来了发展的春天，病理为医之本，然而作为病理科工作中的根本小标本活检技术显得尤为重要，小标本是指直径小于0.3 cm，或者长度小于2 cm的组织，包括经内镜获取的黏膜组织，浅表或深在部位的穿刺物，子宫腔刮取物，经微创手术由器官或肿瘤中切取的不完整组织等。现将制作流程及注意事项介绍如下。

1 材料和方法

1.1 设备和材料

1.1.1 设备

石蜡切片机（德国LEICA2235）、组织包埋机（日本樱花）、组织漂烘仪、恒温烤箱50℃

1.1.2 组织来源

我院病理科所接收到的包括肾穿刺组织、胃肠镜活检组织、支气管镜活检组织、肝穿刺组织、乳腺穿刺组织、皮肤活检组织及其他小组织。

1.1.3 试剂

10%的中性福尔马林固定液、乙醇、二甲苯、石蜡（58～60℃）、苏木素、伊红。

1.2 方法

1.2.1 取材

用活检钳将小块活检组织放到专用的防漏滤膜纸上，包好置于已经编辑好病理号的塑料包埋盒内，然后放入生理盐水5～10分钟。

1.2.2 固定

取材工作结束后，将核对好数目的取材块放入10%的中性缓冲福尔马林固定液中进行补充固定，直接在固定液中加人2‰的伊红染液，经过这样经过补充固定，使得组织被染成伊红色，伊红染料着色鲜艳持久，在包埋、切片、染色整个过程中，标本容易识别，避免了漏取、丢失、 切片不全及过切等问题，极大的提高了工作效率[1]。

1.2.3 脱水

脱水前先将梯度浓度的酒精放置到50℃的恒温烤箱进行加热，然后将固定好的标本分别放入75%乙醇5分钟，85%乙醇5分钟，95%乙醇I中5分钟，9%乙醇II中5分钟，无水乙醇I 3分钟，无水乙醇II 3分钟，二甲苯I和二甲苯II各1分钟，浸蜡10分钟。

1.2.4 包埋

用加热的镊子将组织有序的平整的放入包埋模具中，注意组织紧密集中但不可重叠，大小组织应该放在同一个平面上，用手将模具移至小冷台上，待石蜡将组织凝固后抽出镊子，盖上脱水盒，从侧面轻轻加足量石蜡移至大冷台上。

1.2.5 切片

将蜡块放在冰盒上以利切片，切片厚度为3～4微米，组织较小时应连续切片以免遗漏，将切片贴敷在载玻片上，连续切片不能少于8～10张。

1.2.6 染色

将切片分别放入二甲苯I、II、III中5分钟，然后进入由高到低的梯度乙醇各1分钟，自来水冲洗，苏木素染液5分钟，自来水冲洗，1%的盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗，伊红水溶染液1～3分钟，适度自来水冲洗返蓝，再然后分别进入由低到高的梯度浓度乙醇各30秒，后进入二甲苯透明，中性树胶封固。

2 结 果

经此方法处理过的组织蜡块硬度适中，切片完整薄厚适中，细胞核与胞质着色明显，组织细胞无重叠挤压，细胞形态完好，颜色对比鲜明，可用于后续的免疫组化和分子病理学的检查。

3 讨 论

（1）使用上述手工脱水方法大约需要3小时就可以完成快速制片，与常规机器脱水制片方法（大约需要12小时）相比极大的提高了工作效率，为次日诊断报告的及时发出提供了技术支持。

（2）穿刺及内窥镜活检标本多有挤压，为避免这一现象，尽可能使组织恢复原有形态，可以在取得标本后立即放在生理盐水中浸泡5～10 min，让组织自然舒展，生理盐水加入10%中性缓冲甲醛固定剂[2]。

（3）组织固定时一定要保证固定液的新鲜，固定液要足量，一般要求在组织体积的10～20倍，固定时间为1～12小时。

（4）标本接受和标本取材时需认真核对每例送检标本的编号，编码，姓名与申请单是否一致，认真检查标本瓶固定液是否满意，杜绝张冠李戴式的错误，取材结束后也应再次核实取材内容、组织块数以及编号编码，并在病理检查申请单上签名和签署日期，防止医疗事故的发生。

（5）取材时对于直径小于0.3 cm的组织推荐使用市售的细小标本取材用包埋纸包裹，该包埋纸在组织脱水浸蜡过程中不易粘粘，易分离，包裹时包埋纸不要整齐对折，这样有利于包埋时打开，同时防止小组织在脱水过程中从包埋盒的小孔中漏掉。

（6）组织脱水时乙醇的浓度应为低浓度到高浓度逐渐递增，起始浓度为70～75%为宜，实践证明70～75%乙醇对组织的通透性最佳，可以减缓组织快速过度的皱缩，有利于组织的脱水。加温脱水时恒温烤箱的温度不易超过50摄氏度，温度过高虽然可以缩短组织脱水的时间，但是会使组织过度收缩组织变硬造成切片困难。

（7）石蜡包埋首先是对所使用的石蜡的选择，过硬的组织应该选择较高硬度的石蜡包埋，较软的组织应该选择较低硬度的石蜡包埋。包埋时石蜡的温度过高会将组织烫坏，造成组织变硬、变脆，发生弯曲变形最终影响切片质量，一般蜡缸的温度应高出石蜡的熔点4～6℃。定期清理石蜡中包埋时带入水份和气泡，以免包埋时过多的空气和杂质带到组织蜡块中。多块大小不等的组织在同一蜡块包埋时，组织应紧密排列，同时注意间距不宜过小，以免造成组织重叠。包埋时包埋盒或包埋器皿表面石蜡凝结成蜡膜时才能将组织蜡块移至冷水或冷台上进行冷却，如果速度过快会使蜡块产生龟裂，同样影响切片质量。

（8）切片前先将包埋好的蜡块放入冰箱里冷冻10分钟，或者按排列好的顺序把组织块放到冷却装置上，使得组织蜡块温度降低，适度硬化，这样有利于切片。用锋利的刀切片可以保证连切，使成带状。先进行粗切直到组织完全暴露，然后进行细切直到组织块表面均匀无白点后再进行展片，连切出多个切面，以防切片不全，这样可以找到最严重的病变，以防漏诊，2次展片、捞片使切片充分展开以防折叠，便于观察细胞的结构，也可防止脱片[3]。

（9）石蜡切片时要调整好切片机刀架的角度，一般为20°～30°，刀刃的角度为5°～10°，合适的刀架角度和刀刃角度可以很好的保护刀刃，使得刀刃长久的保持锋利的状态。

（10）石蜡切片时应加装雾化器，雾化器的使用可以起到湿润蜡块和去除静电的作用，雾化器的位置应与组织蜡块保持2-3cm的距离，风速和出雾量调整到恰到好处。

（11）捞片时一般捞片机内水的温度应调节至45℃左右恒定，温度过高会使组织蜡片融化，温度过低则组织蜡片不易展开，容易产生气泡。保持捞片机内水面的清洁，防止污染切片。

（12）染色时常常会出现细胞核染色苍白暗淡，出现这种情况的原因一般为切片在苏木精染液停留的时间过短，苏木精使用时间过长丧失染色能力，盐酸乙醇分化时间过长。伊红染色后在酒精中停留时间不易过长，因为酒精对伊红染液有分化的作用，容易造成伊红的退色现象。

（13）染色中经常会发生组织切片脱落的情况，常见原因为组织固定脱水透明欠佳，组织切片过厚，染色时脱蜡结束后流水冲洗组织切片过度，使得组织切片与载玻片分离。

（14）封片时一般选择中性树胶为封固剂，因为中性树胶可以被二甲苯稀释，其折光率与载玻片的折光率相近，其浓度也要调整适中，染色结束后在留有少量二甲苯的切片上滴加2滴黄豆大小的中性树胶，略微倾斜载玻片，同时将盖玻片轻轻放在组织载玻片上面，这样做可以防止封片时气泡的产生。推荐使用全自动组织切片封片机。

（15）染色时经常会出现染色不均匀，染色背景不分明，染色背景脏掉片的情况，主要原因还是脱蜡不彻底，所以在染色前烤片时间必须适当延长，一般在30分钟以上，温度应控制在65℃左右，染色前苏木素必须去除表面形成的氧化膜，盐酸乙醇分化要恰到好处，保证每步试剂的纯度，定期更换试剂。所以想要得到理想的染色效果必须使用一套合理的适合自己的染色程序。

（16）HE染色的关键步骤时盐酸乙醇的分化和返蓝，盐酸乙醇的浓度应为1%，分化时当切片上的组织颜色由原先的深蓝色逐渐变成粉红色时就说明分化程度已经适中，应当终止分化，然后流水冲洗返蓝。

综上所述，病理科小活检标本制作方法过程繁琐，经过我院多年工作实践及病理科前辈经验总结如上，如上方法制作的病理切片质量满意，最终保证了病理诊断的及时准确，同时也为患者减少了就诊时间，希望此方法能给病理同行借鉴。