足细胞在新月体肾炎中的研究进展

2020-02-27邹荣胡韬韬余秉治

临床肾脏病杂志 2020年11期

邹荣胡韬韬余秉治

430022 武汉，武汉市第一医院肾内科

新月体肾炎是肾脏病领域常见的急危重症，其病理核心为包曼囊内超过50%肾小球新月体形成，且新月体占肾小球面积50%以上。新月体可分为细胞性、细胞纤维性和纤维性新月体，疾病早期以细胞性新月体形成为主[1]。一般认为足细胞并不参与新月体形成，但近十年来临床试验和动物实验研究提示足细胞可能是启动新月体形成的主要细胞，本文就足细胞在新月体肾炎中的相关研究进展作一综述。

一、足细胞桥的发现

2001年，Le Hir等[2]研究抗肾小球基底膜肾炎小鼠模型时发现，造模成功的小鼠肾小球内可见弥漫毛细血管内炎症、新月体形成和足细胞足突广泛融合。最值得注意的是，在肾小球毛细血管襻和壁层上皮细胞间可以看到桥接细胞，该细胞与壁层上皮细胞互相接触，并破坏了壁层上皮细胞之间的紧密连接。桥接细胞存在于新月体形成的早期和发展阶段，并在细胞新月体后期向纤维新月体转变的过程中也能观察到。电镜观察到新月体肾炎模型中足细胞膜形成片状突起，逐渐迁移、黏附鲍曼囊，插入壁层上皮细胞紧密连接之间，在肾小球基底膜(glomerular basement membrane，GBM)和壁层基底膜(parietal basement membrane，PBM)之间形成足细胞桥(podocyte bridge)[2]。通过免疫染色证实这些细胞表达了足细胞特异性标志蛋白如肾母细胞瘤蛋白1(wilms tumor protein1，WT1)，整合素α3亚单位，podocin，synaptopodin和CD2AP，提示它们可能起源于足细胞。

但也有不同意见提出新月体细胞染色未发现足细胞特异蛋白的表达，认为新月体中增殖细胞可能主要来源于壁层上皮细胞，因此，对足细胞参与新月体形成提出质疑。

2004年Moeller等[3]首次报道将足细胞特异性2.5P-Cre转基因小鼠与ROSA26报告小鼠杂交，通过足细胞特异性标记观察到在新月体形成早期即有足细胞迁移并粘附鲍曼囊；病理细胞计数提示新月体细胞中大约有50%细胞来源于足细胞；从而证实了足细胞是参与新月体形成的重要细胞。2016年Succar及其同事利用透射电镜技术再次证实了足细胞桥的形成。他们使用肾毒血清(nephrotoxic serum，NTS)诱导建立新月体肾炎小鼠模型，分别在造模结束后第1、2、3、5、7、14天通过透射电镜观察肾小球变化。第1天相邻足细胞的胞体之间广泛形成了接触，并且在胞体接触部位出现紧密连接。免疫荧光可以检测到紧密连接蛋白(zonula occludens-1,ZO-1)表达增加。第2天，足细胞之间距离减少，肾小球基底膜厚度增加。第3天足细胞足突融合(foot process effacement，FPE)，第5天足突广泛融合，并在毛细血管襻和鲍曼囊之间可以观察到足细胞桥形成。在第7天和第14天，所有肾小球中都出现了纤维素样坏死和细胞新月体形成[4]。因此有人提出，足细胞桥的出现可能是新月体形成的关键起始事件。

二、足细胞迁移与新月体形成

正常肾小球中的足细胞是高度分化成熟的细胞，稳定表达成熟足细胞的标记蛋白如足细胞骨架蛋白、裂孔隔膜蛋白复合体、顶膜区结构蛋白、基底区连接膜蛋白，一般不具有迁移能力[5]。但足细胞在发育过程中或病理损伤之后，足突会形成伪足样结构，这种结构有的表现为宽膜突起，被称为板状伪足，有的表现为长而细的尖锐结构，被称为丝状伪足。足细胞通过足突骨架蛋白的收缩将伪足向前推进延伸。足细胞底部的粘着斑复合物原本将足突固定在肾小球基底膜上，在病理损伤后参与足细胞的运动。足细胞每次运动都涉及到足突与基底膜粘着点的破坏与重建，并在丝状伪足向前移动时锚定到新的位置。这个过程称为足细胞的迁移[6]。足细胞迁移能力的获得是足细胞成为桥接细胞、启动新月体形成的前提条件。

研究证实，许多足细胞成熟标记蛋白的表达或功能异常参与并调控足细胞迁移。Rho-GTPases是调节足细胞骨架蛋白、调控足细胞迁移的重要蛋白家族。Rho(Ras homologous)家族的小GTPases属于Ras超家族，分子量20 000～30 000，存在于所有真核细胞生物中，通过影响细胞骨架肌动蛋白重建、细胞和细胞之间、细胞和基质之间的粘附来作为分子开关在细胞迁移中发挥核心作用。Cdc42、Rac1和RhoA是Rho-GTPases家族的主要成员。RhoA定位于人染色体3p21.3区域，基因全长53 kDa，通过促进胞体及肌动蛋白-肌球蛋白应力纤维的形成，调节收缩性肌动蛋白和肌球蛋白微丝的聚合，维持足细胞细胞骨架的稳定，其在成纤维细胞中可诱导黏着斑和应力纤维的生成。应用活化的RhoA转染小鼠足细胞，可促进细胞迁移[7]。Rac调节层状伪足的形成和皱褶，还可与TRPC6形成复合物，由TRPC6介导的Ca2+内流，可升高Rac活性，促使足细胞迁移。Cdc42主要参与调节丝状伪足的形成，从而调节足细胞的迁移行为[8]。

Synaptopodin属于足细胞骨架蛋白，分子量100 kDa，是一种富含脯氨酸的肌动蛋白相关蛋白，仅表达于成熟分化的足细胞。已有研究证实，Synaptopodin能够从多个方面影响足细胞迁移行为。 Synaptopodin能够与肌动蛋白成束蛋白α-actinin-4连结而调节肌动蛋白成束功能，影响 F-actin 的聚集和解聚，从而调节足细胞的“可塑性”[9]；Synaptopodin通过竞争性阻断Smurf1介导的RhoA泛素化降解，从而诱导应力纤维的形成[10]。也有研究发现，synaptopodin直接与接头蛋白IRSp53相连接，通过Cdc42-IRSp53-Mena复合物抑制足细胞丝状伪足的形成，维持足细胞在基底膜上的锚定状态。Synaptopodin基因缺失的小鼠表现出肾脏足细胞压力丝缺失，形成异常非极性的层状伪足，阻止细胞迁移[11]。

Podocin、Nephrin和CD2相关蛋白(CD2-associated protein，CD2AP)是目前已经确定的三种裂孔隔膜蛋白，三种蛋白相互作用，共同形成裂孔隔膜蛋白复合体，稳定裂孔隔膜完整性[5]。CD2AP 作为重要的胞内接头蛋白，不仅与nephrin和podocin直接作用，而且可直接与纤丝状肌动蛋白连接以调节细胞骨架的组成和排列[12]。 Podocin分子量42 kDa，NPHS2基因编码，由383个氨基酸残基组成。其结构呈发卡样，定位于裂孔隔膜的脂类微功能域，通过瞬时受体电位通道蛋白6(transient receptor potential channel 6，TRPC6)的集聚发挥机械感受器的作用。当足细胞受到机械性刺激时，出现细胞骨架蛋白的重排和足突收缩。裂孔隔膜结构分子的异常可以引起足细胞骨架的重排，并推测可能进一步影响足细胞迁移能力的获得，但它们在足细胞迁移中的作用机制还需要进一步研究和证实[13]。

研究发现，胞内信号通路活化也参与了足细胞迁移。哺乳动物Notch信号通路由四种受体(Notch1、Notch 2、Notch3和Notch 4)，五种配体(DLL 1、DLL 3、DLL 4、Jagged 1和Jagged 2)构成。Notch信号通路调控几乎涉及所有细胞的增殖和分化活动，其调控过程可概括为：配体与Notch受体胞外区域结合—Notch胞内胞外段分离—可溶性活性Notch受体胞内区(NICD)进入细胞核—形成CLS—ICN复合体—激活下游靶基因转录[14]。肾毒血清能诱导正常小鼠足细胞上调Notch3受体及其靶基因HeyL表达；通过基因工程技术在足细胞过表达Notch3活化细胞内结构域，观察到足细胞肌动蛋白细胞骨架重组，表现出迁移特性。在体内抑制Notch3表达能有效抑制肾内炎症细胞聚集和新月体形成[15]。

表皮细胞生长因子(epidermal growth factor，EGF)及其下游信号通路激活也参与足细胞迁移。 Bollee等[16]在肾毒血清诱导的新月体肾炎模型中观察到EGF介导的磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)信号通路活化。该信号通路激活能诱导足细胞环状F-肌动蛋白结构(RiLiS)形成，而RiLiS结构是足细胞顶端突起和顶端迁移能力获得的标志性改变。

虽然体内足细胞是高度分化的成熟细胞，一般情况下不具有迁移能力，但在新月体肾炎模型中多次观察到足细胞失去正常极性并成为具有迁移能力的细胞，说明足细胞迁移能力的获得可能是足细胞桥和新月体形成的基础条件。

三、足细胞增殖与新月体形成

Reidy等[17]认为，足细胞发生表型转化时将失去成熟足细胞原有的蛋白标记分子，如Nephrin、synaptopodin等，转而表达上调的间充质细胞样表型标志物，如成纤维细胞特殊蛋白Ⅰ、整合素连接激酶、纤维连接蛋白、基质金属蛋白酶 9等。已经证实高糖和转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)等可以诱导体外培养足细胞发生表型转化[18]，美国匹兹堡大学 Liu等[19]利用TGF-β刺激体外培养的足细胞，足细胞原有标记蛋白如 Nephrin、P-cadherin、ZO-1等减少，转而表达间充质细胞蛋白分子，如基质金属蛋白酶9、结蛋白等，进而导致足细胞功能紊乱，滤过膜完整性丧失。在新月体肾炎患者的肾活检标本中也发现成熟足细胞丢失[20]、足细胞表型改变[21]和足细胞来源的新月体细胞高表达增殖蛋白如增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)和Ki67[22]，提示足细胞可能在新月体形成过程中发生了由高度分化的成熟细胞表型向具有增殖能力的表型转化。正常情况下，巢蛋白Nestin仅表达在成熟足细胞胞浆及初级足突。Thorner等[23]观察35例肾活检标本，发现新月体中增殖细胞也表达巢蛋白Nestin，并且在肾小球毛细血管襻和壁层上皮细胞之间可以观察到巢蛋白阳性的桥接细胞，进一步证实了新月体形成过程中足细胞增殖的存在。

多数肾病类型的病理进展中，足细胞数目不断减少。但部分类型肾病，如细胞型局灶节段性肾小球硬化、塌陷型肾小球病和人类免疫缺陷病毒相关性肾病却出现了足细胞增殖的情况[18]。足细胞增殖也见于新月体肾炎病理损伤。选择性删除足细胞中von Hippel Lindau(Vhlh)基因，稳定了缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor，HIF)α亚基，随后上调HIF靶基因如血管内皮生长因子A、趋化因子受体4(chemokine receptor 4，CXCR4)及其配体的表达。Vhlh突变小鼠发育4周时发生肾小球性血尿和蛋白尿，肾脏病理显示新月体形成和足细胞增殖。该病理过程与足细胞HIF靶基因CXCR4特异性表达上调密切相关，诱导CXCR4变异足以引起足细胞增殖和新月体形成。给予抗CXCR4抗体能有效改善Vhlh突变小鼠新月体肾炎的严重程度[24]。该研究提示受损的去分化足细胞增殖可能是为了弥补缺失的正常足细胞，而增殖的足细胞在鲍曼囊内堆积，又参与新月体形成。

Dai及其同事也观察到新月体肾炎中足细胞增殖的存在，并证明足细胞增殖与信号传导及转录激活蛋白3(signal transducer and activator of transcription，STAT3)的激活有关[25]。STAT是一种转录激活因子，被各种胞外细胞因子和生长因子信号激活后进入胞核内与靶基因启动子序列的特定位点结合，促进其转录[26]。在NTS诱导的新月体肾炎模型中，足细胞STAT3的激活及其下游靶基因表达增加。通过基因工程技术诱导足细胞特异性缺失STAT3，观察到STAT3缺失减轻了NTS诱导的新月体形成和肾脏损伤。STAT3缺失可通过阻止壁层上皮细胞募集和下调足细胞分化标志物、抑制足细胞增殖来减少新月体的形成。该研究提示足细胞STAT3的激活对于新月体肾小球肾炎的发展至关重要，推测IL-6和EGF可能由内在的肾小球细胞(足细胞，肾小球系膜细胞和内皮细胞)和募集到肾小球的循环免疫细胞(淋巴细胞)产生。然后，IL-6和EGF在受损肾小球中的局部蓄积可以激活足细胞中的JAK/STAT信号传导，并启动足细胞增殖，足细胞标记物的丢失和壁层上皮细胞的募集，最终导致新月体形成[25]。细胞增殖由所处的细胞周期决定，而细胞周期受细胞周期蛋白cyclin的调控。不同时相的cyclin激活特定的细胞周期素依赖性激酶(cyclin-dependent kinases，CDK)而引起细胞增殖。cyclin-CDK复合物受CDK抑制蛋白(CDK-inhibitor，CDKI)P21、P27和P57调控。大多数肾小球疾病时足细胞难以增殖的原因是CDKI表达没有削弱反而得到了加强。然而部分病理类型的足细胞损伤时，细胞周期调控失衡导致足细胞增殖。Shankland等[27]研究发现，不同肾病类型CDKI表达不同，在微小病变和膜性肾病组，P21、P27和P57表达与正常肾脏无明显差异，但在细胞型局灶节段性肾小球硬化、塌陷型肾小球病和HIVAN组，足细胞P27和P57表达受抑制，激活了与有丝分裂相关的细胞周期蛋白，从而促使足细胞发生增殖[28]。在新月体肾炎患者肾组织中也观察到细胞周期蛋白cyclin A和B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)表达上调，CDK抑制蛋白p27表达减弱[29]。该现象提示细胞周期蛋白参与了新月体肾炎的病生过程。但足细胞是否发生细胞周期蛋白调节失衡，细胞表型变化是否与细胞周期蛋白有关，仍需要进一步深入研究。

抑制足细胞增殖也可以减轻新月体肾炎中肾组织损伤。肾毒血清诱导的新月体肾炎小鼠模型中观察到microRNA-92a表达上调，并抑制p57kip2的表达，从而诱导足细胞经历分化表型的失调和增殖。给予抗miR-92a抗体可以防治小鼠白蛋白尿和肾功能衰竭，表明miR-92a抑制可以作为RPGN的潜在治疗策略[30]。同样，在NTS诱导的新月体肾炎小鼠模型中，Dai等[31]观察到维甲酸(retinoic acid，RA)通过激活RA受体α(retinoic acid receptor alpha，RARα)抑制足细胞增殖，恢复足细胞标志蛋白的表达，RA治疗能显著减轻足细胞损伤，改善肾功能并减少小鼠的新月体数量，敲除RARα，RA的保护作用在新月体肾炎模型小鼠中不再呈现。

有证据表明，转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferators-activated receptorγ，PPARγ)的表达可以预防足细胞损伤。肾毒血清诱导的新月体肾炎小鼠模型中足细胞PPARγ表达丰度和转录活性明显下降，噻唑烷二酮(thiazolidinediones，TZD)的治疗能够提高足细胞对损伤的耐受性，有效减轻新月体的形成和肾脏损害。该研究提示PPARγ途径可能是新月体肾炎的治疗靶标之一[32]。对这些研究结果的综合解释是在各种致病因素的作用下，足细胞可能失去他们分化成熟的细胞标记，向增殖细胞表型转化并获得迁移能力；足细胞桥形成以后，足细胞与壁层上皮细胞相互接触，相互影响，诱导足细胞、壁层上皮细胞、巨噬细胞等大量增殖，并释放炎症因子，从而推动新月体形成的病理进程[33]。