组成型分泌表达蛋白酶的重组粪肠球菌的构建及应用

郭建军，曾静，袁林，魏国汶

(江西省科学院微生物研究所，江西 南昌,330096)

目前我国饲料产业面临的主要问题是蛋白质饲料原料等资源匮乏，对进口的依存度很高，其中75%以上的大豆依靠进口[1]。随着国际大豆价格走高，畜禽养殖成本也将逐渐加大。此外，蛋白质饲料的利用率偏低，这影响了畜禽产品的质量，也增加了畜禽养殖的成本[2]。因此，寻找优质、廉价的蛋白饲料原料替代资源，以及利用现代生物技术手段改善动物饲料的品质，提高动物饲料中蛋白质的利用率，是当前我国饲料工业的重要发展方向[3-4]。

在猪禽营养中，高效的蛋白质消化率有利于更有效、更充分地实现饲料原料的应用，保证生产效率，维持猪禽肠道健康和减少环境中氨氮的排放[5-9]。除了对蛋白质营养的贡献外，蛋白酶也可以协助释放其他养分，降解蛋白质类抗营养因子和抗原[10]。因此如何提高动物粗饲料中蛋白质利用率是许多研究者一直关注的重要课题。解决该问题的一种有效方法就是利用产蛋白酶的微生物来提高动物粗饲料中蛋白质的降解率。随着基因工程技术的发展以及对乳酸菌表达系统的深入研究，利用基因工程技术来构建表达外源蛋白酶的乳酸菌基因工程菌，并利用该乳酸菌基因工程菌直接发酵处理动物粗饲料，或者将其作为活菌制剂来帮助动物提高粗饲料中蛋白质降解率都是便捷、有效的方法[11]。

利用乳酸菌作为宿主菌来表达外源蛋白酶具有许多优势，例如易构建获得安全级的基因表达系统，对胆盐具有较好的耐受能力等[12]。并且大多数乳酸菌属于动物胃肠道的共生菌，可以在动物特定的消化道区域定植，这使其成为表达外源水解酶的理想工具[13-16]。但是乳酸菌表达系统与其他原核表达系统或真核表达系统相比仍存在外源蛋白质表达量偏低、遗传背景不够清楚等问题[17]。乳酸菌作为基因工程菌进行应用时，能否高效稳定的将外源蛋白质分泌至胞外发挥生物学作用至关重要。组成型表达系统可以在无其他信号刺激的条件下使乳酸菌宿主菌持续稳定表达外源蛋白质[18]，高效的乳酸菌信号肽可以有效引导外源蛋白质分泌至胞外[19-20]。因此，构建组成型分泌表达外源蛋白质的重组乳酸菌具有重要意义，在生产实践中也具有更大的应用潜力。

本研究以本实验室前期从健康仔猪肠道黏膜上分离纯化得到的具有优良益生特性的粪肠球菌EXW27 为宿主菌，以大肠杆菌-乳酸菌穿梭质粒pSIP401为表达载体的基础框架，通过对表达载体中启动子和信号肽进行替换，来构建组成型分泌表达地衣芽孢杆菌BacilluslicheniformisBBE11-1中角蛋白酶Ker[21]的重组粪肠球菌。并进一步利用该重组粪肠球菌对豆粕进行固态发酵处理，通过比较发酵前后豆粕的各项指标[22]来研究该工程菌用于动物粗饲料体外发酵或者作为活菌制剂的可行性。本研究对于探索制备新型微生态制剂具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验菌种及培养基

本研究所用大肠杆菌EscherichiacoliJM109、粪肠球菌EnterococcusfaecalisEXW27、大肠杆菌-乳酸菌穿梭质粒pSIP401、重组质粒pSTOP1622-kerhds均由本实验室保存；所用培养基为LB培养基和MRS培养基。

1.1.2 主要实验材料

KOD-Plus-neo DNA聚合酶，日本Toyobo公司；DNA限制性内切酶、T4DNA连接酶、DNA Marker、蛋白质Marker，美国Fermentase公司；DNA胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒E.Z.N.A.，美国Omega Bio-tek公司； Chelating SepharoseTMFast Flow，美国GE Healthcare公司；Bradford法蛋白浓度测定试剂盒、PCR引物，上海生工生物工程股份有限公司；豆粕，江西鑫维生物技术有限公司；实验所用试剂均为分析纯。

1.1.3 主要仪器与设备

Mastercycler gradient 型PCR仪，美国Eppendorf公司；TY04S-3C型凝胶成像系统，北京君意东方电泳设备有限公司；SCIENTZ-ⅡD型超声波细胞破碎仪，宁波新芝生物科技股份有限公司；SP-752PC型紫外可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 分子克隆技术和表达产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)分析

分子克隆技术和表达产物的SDS-PAGE分析参照文献[23]进行。

1.2.2 重组质粒pSIP401Z-kerhds的构建与鉴定

基于蛋白酶ker的碱基序列，设计引物P1和P2，如表1所示。以重组质粒pSTOP1622-kerhds为模板，采用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增基因ker中不含信号肽的结构基因kerhds。PCR扩增条件为：98 ℃ 5 min；98 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，74 ℃ 1 min，35个循环；74 ℃ 5 min。扩增产物经XhoI和KpnI双酶切，连接至经同样双酶切处理的载体pSIP401，构建重组质粒pSIP401-kerhds。将连接产物转化大肠杆菌E.coliJM109感受态细胞，将转化产物全部涂布于含200 μg/mL红霉素的LB固体平板上，于37 ℃过夜培养。挑取LB固体平板上转化子，提取其中所含重组质粒。采用XhoI和KpnI双酶切重组质粒鉴定是否有外源基因的插入。

注：下划线标注的部分为限制性酶切割位点

在质粒pSIP401-kerhds的基础上，参照文献[24]中启动子替换方法，根据质粒pSIP401和基因ker的碱基序列设计引物P3和P4，将重组质粒pSIP401-kerhds中启动子替换为本实验室前期研究工作筛选得到的粪肠球菌中高组成型表达启动子p10，构建重组质粒pSIP401Z-kerhds。其中p10的碱基序列为：AGATCTGCATAAAAAGTTCTTGACACTATATTAAGG CATTGTTAAGATATAGAAATAGCG。具体实验步骤如下：以重组质粒pSIP401-kerhds为模板，采用引物P3和P4进行PCR扩增。PCR扩增条件为：98 ℃ 5 min；98 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，74 ℃ 10 s，30个循环；74 ℃ 5 min。扩增产物经BglII和NcoI双酶切，连接至经同样双酶切处理的载体pSIP401-kerhds，构建重组质粒pSIP401Z-kerhds。将连接产物转化大肠杆菌E.coliJM109感受态细胞，将转化产物全部涂布于含200 μg/mL红霉素的LB固体平板上，于37 ℃过夜培养。挑取LB固体平板上转化子，提取其中所含重组质粒。将重组质粒送至上海生工生物工程股份有限公司进行测序，并与对应基因序列进行比对确认。

1.2.3 信号肽筛选载体的构建与鉴定

根据文献[25]提供的粪肠球菌来源的信号肽的基因序号，在NCBI中查询基碱基序列。采用化学全合成方法合成包含限制性酶切位点NcoI和XhoI以及信号肽碱基序列的DNA片段：5’-AGCCATGG(NcoI)-信号肽碱基序列-CTCGAG(XhoI)TG-3’。所合成的DNA片段经NcoI和XhoI双酶切，连接至经同样双酶切处理的载体pSIP401Z-kerhds，构建信号肽筛选载体。将连接产物转化大肠杆菌E.coliJM109感受态细胞，将转化产物全部涂布于含200 μg/mL红霉素的LB固体平板上，于37 ℃过夜培养。挑取LB固体平板上转化子，提取其中所含重组质粒。将重组质粒送至上海生工生物工程股份有限公司进行测序，并与对应基因序列进行比对确认。

表2 粪肠球菌来源的信号肽Table 2 signal peptides from Entercoccus faecalis

1.2.4 粪肠球菌E.faecalisEXW27的电击转化

粪肠球菌E.faecalisEXW27的电击转化方法参照参考文献[26]进行。将重组质粒电击转化粪肠球菌E.faecalisEXW27，将转化产物全部涂布于含10 μg/mL 红霉素的MRS固体平板上，37 ℃培养24 h，获得重组粪肠球菌。

1.2.5 蛋白酶在粪肠球菌中的组成型分泌表达和纯化

接种重组粪肠杆菌单克隆到含10 μg/mL红霉素的MRS液体培养基中，用250 mL三角瓶进行培养，其中培养基的装液量为100 mL，于37 ℃静置培养，培养时间为24 h。然后转接该培养物于新鲜含10 μg/mL红霉素的MRS液体培养基中，用250 mL三角瓶进行培养，其中培养基的装液量为100 mL，接种量为3%(体积分数)，于37 ℃静置培养，培养时间为36 h。待培养结束后，于4 ℃下8 000 r/min离心5 min，分别收集菌体沉淀和发酵液上清，采用SDS-PAGE检测发酵液上清和重组粪肠球菌胞内的蛋白酶表达情况，并测定发酵液上清和重组粪肠球菌胞内的蛋白酶酶活。其中发酵液上清直接用于蛋白酶酶活检测；重组粪肠球菌菌体采用50 mmol/L Tris-HCl，pH 9.0缓冲液重悬后，置于冰上采用超声波处理菌体细胞至菌体悬液变为均一溶液后，再用于蛋白酶酶活检测。

采用Ni2+亲和层析柱对发酵上清液中目的蛋白质进行纯化，用250 mmol/L咪唑洗脱缓冲液洗脱，即得到纯化后的重组蛋白酶。利用SDS-PAGE检测重组蛋白酶的纯度，并采用Bradford法[27]测定重组蛋白酶的浓度。

1.2.6 蛋白酶的酶学性质分析

1.2.6.1 蛋白酶的酶活力测定

取250 μL酶液于离心管中，向实验组管中加入250 μL 20 g/L酪蛋白底物溶液(50 mmol/L Tris-HCl，pH 9.0)，对照组中加入500 μL 40%(质量浓度)TCA溶液，摇匀。于40 ℃反应30 min后，立即向实验组中加入500 μL 40%(质量浓度)TCA溶液，对照组中加入250 μL 20 g/L酪蛋白底物溶液，并混匀。室温放置15 min后，12 000×g离心10 min，转移上清液于新的离心管中，并于280 nm处测定光吸收值。蛋白酶活力单位(U)定义为：在40 ℃、pH 9.0的条件下，每分钟使上述反应体系中上清液的A280nm升高0.01所需要的酶量为1 U。重组粪肠球菌胞外蛋白酶的比酶活力(U/mL)定义为：在40 ℃、pH 9.0的条件下，单位体积(mL)发酵上清液每分钟使上述反应体系中上清的A280nm升高0.01所需要的酶量为1 U。

1.2.6.2 蛋白酶的最适反应温度

按照上述反应体系混合酶液和底物，分别于20～80 ℃反应30 min，测定不同温度条件下酶活力。将所测得的最高酶活力定义为100%，并以相对酶活力的百分比对温度作图，确定其最适反应温度。

1.2.6.3 蛋白酶的最适反应pH和pH稳定性

将酶液与不同pH 的20 g/L酪蛋白底物溶液混合，于40 ℃下进行酶活力测定。采用不同缓冲液配制不同pH的20 g/L酪蛋白底物溶液：50 mmol/L 2-吗啉乙磺酸缓冲液(pH 3.0～7.0)、50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.0～10.0)。将所测得的最高酶活力定义为100%，并以相对酶活力的百分比对pH作图，确定其最适反应pH。

将酶液与不同pH值的Britton-Robinson缓冲液(pH 2.0～10.0)混合，分别于40 ℃保温2 h后取出样品，根据如上反应体系测定酶活力。将未处理酶液的酶活力定义为100%，并以相对酶活力的百分比对pH值作图，评价酶的pH稳定性。

1.2.6.4 蛋白酶于胆盐溶液中的稳定性

将酶液与不同浓度的胆盐溶液混合，混合溶液中胆盐终质量浓度分别为0、0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%。将混合物于40 ℃保温2 h后取出样品，根据如上反应体系测定酶活力。将未处理的酶液的酶活力定义为100%，并以相对酶活力的百分比对胆盐质量浓度作图，评价酶于胆盐溶液中的稳定性。

1.2.7 豆粕固态发酵实验

1.2.7.1 粪肠球菌的制备

挑取新鲜的粪肠球菌单菌落，接种于15 mL 含10 μg/mL红霉素的MRS液体培养基中，37 ℃静置培养12 h后得到一级种子液，按照1%(体积分数)接种于250 mL 含10 μg/mL红霉素的MRS液体培养基中，37 ℃静置培养36 h，菌体浓度达到109CFU/mL。

1.2.7.2 豆粕的固态发酵

将风干的豆粕、水、糖蜜以及粪肠杆菌菌液按照不同的配比混合均匀后，置于经无菌处理的自封袋中，封口置于37 ℃培养箱中发酵48 h。取出后55 ℃烘干、粉碎，进行样品的pH值、粗蛋白质含量、小肽含量、粗蛋白质体外消化率的检测。以上所述水的加入量占豆粕总质量的50%，糖蜜原液的加入量占豆粕总质量的3%，菌液接种量占豆粕总质量的5%。

1.2.7.3 样品的粗蛋白质含量检测

称取1 g豆粕样品、0.2 g CuSO4、6 g K2SO4，混合均匀后放入消化管中，向其中加入10 mL H2SO4，然后将消化管放到消化装置上消化(420 ℃、2 h)，将消化好的样品用凯氏定氮仪测定其中蛋白质含量。

1.2.7.4 样品的小肽含量检测

发酵前后豆粕中小肽含量的测定参照参考文献[2]进行。

1.2.7.5 样品的粗蛋白质体外消化率检测

准确称取1 g豆粕样品于100 mL三角烧瓶中，加入10 mL、3 mg/mL、pH 2.0的胃蛋白酶(1∶3 000，质量比)溶液，37 ℃恒温振荡(180 r/min)水解6 h。取出后立即滴加少许10 mol/L的NaOH溶液调节pH至中性，再加入50 mL、0.5 mg/mL、pH 7.6的胰蛋白酶(1∶250，质量比)溶液，37 ℃恒温振荡(180 r/min)水解18 h。取出后用50 g/L TCA溶液分3次，每次5 mL清洗三角瓶转入100 mL离心管中，以沉淀未消化的大分子蛋白质。空离心管事先编号并称重。在4 ℃、8 000×g条件下离心20 min，小心去除上清液，连同离心管一起置于60 ℃烘箱中烘干至恒重，记录离心管质量，2次质量差即为残渣质量。将豆粕样品与残渣一起利用凯氏定氮仪进行粗蛋白质含量的测定。粗蛋白质体外消化率(CP·Dig)按照公式(1)计算：

(1)

式中：m0，初始豆粕样品质量，m0=1 g；m1，残渣质量，g；CP0，初始豆粕样品中粗蛋白含量，%；CP1，残渣中粗蛋白含量，%。

1.3 数据分析

以上每个实验做3个平行。运用软件SigmaPlot 12.5对试验数据进行统计分析并作图，数据均以x±s表示。

2 结果与分析

2.1 组成型分泌表达蛋白酶Ker的重组粪肠球菌的构建

本研究为实现蛋白酶Ker在粪肠球菌EXW27中的组成型分泌表达，首先采用本实验室前期研究工作筛选得到的粪肠球菌中高组成型表达启动子p10替换表达载体pSIP401-kerhds中启动子，获得组成型表达载体pSIP401Z-kerhds。然后根据粪肠球菌来源的8种信号肽的碱基序列，设计构建蛋白酶Ker在粪肠球菌EXW27中组成型分泌表达的信号肽筛选载体pSIP401Z-s1-kerhds、pSIP401Z-s2-kerhds、pSIP401Z-s3-kerhds、pSIP401Z-s4-gtamyhds、pSIP401Z-s5-kerhds、pSIP401Z-s6-kerhds、pSIP401Z-s7-kerhds、pSIP401Z-s8-kerhds。将以上信号肽筛选载体分别电击转化粪肠球菌EXW27，获得重组粪肠球菌。以转化了质粒pSIP401的重组粪肠球菌为阴性对照C1，以转化了重组载体pSIP401Z-kerhds的重组粪肠球菌为阴性对照C2。重组粪肠球菌于37 ℃静置发酵，待发酵结束后，经离心分别收集发酵上清液和菌体沉淀。发酵上清液直接用于蛋白酶的酶活力测定和SDS-PAGE检测，菌体沉淀经超声波破碎处理后再用于蛋白酶的酶活力测定和SDS-PAGE检测。

重组粪肠球菌的发酵上清液和细胞的蛋白酶比酶活力测定结果如图1所示。阴性对照C1(即转化了质粒pSIP401的重组粪肠球菌)的发酵上清液和细胞中蛋白酶的比酶活力较低。阴性对照C2(即转化了重组载体pSIP401Z-kerhds的重组粪肠球菌)的发酵上清液中蛋白酶的比酶活力较低，而其胞内蛋白酶的比酶活力较高，即未经信号肽引导，重组Ker主要位于重组粪肠球菌的细胞内。而来源于粪肠球菌的8种信号肽均能引导重组Ker分泌至胞外，其中信号肽S6的引导效率优于其他信号肽。经信号肽S6引导，该重组粪肠球菌的发酵上清液中蛋白酶的比酶活力可达到125.37 U/mL。

C1-pSIP401；C2-pSIP401Z-kerhds；S1-pSIP401Z-s1-kerhds；S2-pSIP401Z-s2-kerhds；S3-pSIP401Z-s3-kerhds；S4-pSIP401Z-s4-kerhds；S5-pSIP401Z-s5-kerhds；S6-pSIP401Z-s6-kerhds；S7-pSIP401Z-s7-kerhds；S8-pSIP401Z-s8-kerhds图1 不同信号肽对比酶活力的影响Fig.1 Signal peptide dependence of α-amylase activity

重组粪肠球菌的发酵上清液和细胞的SDS-PAGE检测结果如图2和图3所示。图2显示转化了不同信号肽筛选载体的重组粪肠球菌的发酵上清液中均有1条约为30 kD的蛋白质条带，而阴性对照C1和阴性对照C2的发酵上清液中未见明显的大小为30 kD的蛋白质条带。并且使用信号肽S6后，重组粪肠球菌发酵上清液中重组Ker的表达量明显提高，这与胞外蛋白酶的比酶活力测定结果是一致的。图3显示阴性对照C2以及转化了信号肽筛选载体的重组粪肠球菌的发酵菌体中均能观察到约36 kD的蛋白质条带，而阴性对照C1的发酵菌体中未能明显观察到大小相同的蛋白质条带。该36 kDa的蛋白质条带可能是未经信号肽引导分泌至胞外而滞留在胞内的蛋白质前体物质。

M-蛋白质Marker；C1、S1～S8、C2图2 重组粪肠球菌发酵上清液的SDS-PAGE检测Fig.2 SDS-PAGE analysis of fermentation supernate ofrecombinant E. faecalis注：图中箭头标示为目的蛋白。同图1(下同)

图3 重组粪肠球菌细胞的SDS-PAGE检测Fig.3 SDS-PAGE analysis of recombinant E. faecalis

2.2 重组Ker的表达与酶学性质研究

2.2.1 重组Ker在粪肠球菌EXW27中表达及纯化

对转化了重组载体pSIP401Z-s6-kerhds的重组粪肠球菌进行发酵培养。待发酵结束后，对培养物进行离心处理，收集发酵上清液，并采用Ni2+亲和层析柱对发酵上清液中目的蛋白质进行纯化。重组蛋白酶Ker在粪肠球菌EXW27中的组成型分泌表达及纯化的SDS-PAGE检测分析结果如图4所示。重组蛋白酶Ker的分子质量约为30 kDa，与理论值基本一致。

Ker-经Ni2+亲和层析柱纯化后的重组Ker图4 重组Ker在粪肠球菌EXW27中表达及纯化的SDS-PAGE检测Fig.4 SDS-PAGE analysis of expression and purificationof recombinant Ker in E. faecalis EXW27

2.2.2 温度对重组Ker酶活力的影响

按照蛋白酶酶活力测定反应体系将混合酶液和底物，分别于20～80 ℃反应30 min，测定不同温度条件下酶活力，将所测得的最高酶活力定义为100%，并以相对酶活力的百分比对温度作图，确定重组Ker的最适反应温度，结果如图5所示。重组Ker的最适反应温度为40 ℃，此时比酶活力为1 236.91 U/mg。

图5 温度对重组Ker酶活力的影响Fig.5 Temperature dependence of protease activity ofrecombinant ker

2.2.3 pH值对重组Ker酶活力的影响

将酶液于不同pH 3.0～9.0条件下测定重组Ker的酶活力，将所测得的最高酶活力定义为100%，然后以相对酶活力对pH值作图，结果如图6所示。

图6 pH对重组Ker酶活力的影响Fig.6 pH dependence of protease activity of recombinant Ker

重组蛋白酶Ker的最适反应pH值为9.0，并且重组Ker在pH 5.0～10.0范围内具有50%以上相对酶活力。此外，重组蛋白酶Ker的pH稳定性如图7所示，其在pH 5.0～10.0范围内于40 ℃保温2 h仍具有50%以上的剩余酶活力。以上研究结果表明，蛋白酶Ker属于碱性蛋白酶，其在碱性pH值范围内酶活力最高，稳定性最强，因此在小肠的pH值条件[28]下可以高效工作；在胃肠道前段pH值为3.0～5.0条件[28]下，重组Ker仍具有较高的酶活力和pH稳定性。

图7 pH对酶稳定性的影响Fig.7 pH stability of protease activity

2.2.4 重组Ker在胆盐溶液中的稳定性

将重组蛋白酶Ker于40 ℃分别于0～3.0 g/L胆盐溶液中保温2 h，测定其相对酶活力，分析其在胆盐溶液中稳定性，结果如图8所示。重组蛋白酶Ker在0～3.0 g/L胆盐溶液中具有85%以上相对酶活力，多数动物肠道胆盐质量浓度范围为0.3～3.0 g/L[28]，即重组蛋白酶Ker对动物肠道胆盐具有较好的耐受性。

图8 重组Ker于胆盐溶液中的稳定性Fig.8 Stability of recombinant Ker in bile salts

2.3 豆粕固态发酵结果

采用本研究构建的组成型分泌表达蛋白酶Ker的重组粪肠球菌对豆粕进行固态发酵，以接种粪肠球菌EXW的豆粕样品为对照，并测定发酵前后豆粕样品的pH值、粗蛋白质含量、小肽含量以及粗蛋白质体外消化率，结果如表3所示。豆粕原料经过粪肠球菌固态发酵处理后，各项指标均发生明显变化，并且经本研究所获得的重组粪肠球菌处理后的各项指标优于经粪肠球菌EXW27发酵处理后的。与经粪肠球菌EXW27发酵处理的豆粕样品相比，经本研究所获得的重组粪肠球菌发酵处理后的豆粕样品的pH值更低，粗蛋白质含量、小肽含量以及粗蛋白质体外消化率更高。其中pH值降低了15.47%，粗蛋白质含量提高了12.51%，小肽含量提高了186.69%，粗蛋白质体外消化率提高了29.85%。这表明，经过重组粪肠球菌发酵处理豆粕，可更有效降解豆粕中蛋白质，并产生更多小分子酸。

表3 豆粕固态发酵实验结果Table 3 results of solid state fermentation of soybean meal

3 结论

本研究构建了组成型分泌表达蛋白酶Ker的重组粪肠球菌，其胞外蛋白酶的比酶活力可达125.37 U/mL。重组蛋白酶Ker的最适反应温度为40 ℃，最适反应pH为9.0，在pH值5.0～10.0范围内具有较高的相对酶活和稳定性，并对胆盐溶液具有较好的耐受性。重组蛋白酶Ker的酶学性质使其适用于动物肠道环境。此外，豆粕固态发酵实验表明，与野生型粪肠球菌EXW27相比，重组粪肠球菌可以更有效降解豆粕中蛋白质。本研究表明该重组粪肠球菌用于动物粗饲料体外发酵或作为活菌制剂具有一定的效果。