产细菌素植物乳杆菌Q7对酸奶后酸化及品质的影响

杨慧，步雨珊，刘奥，刘同杰，张兰威，易华西

(中国海洋大学 食品科学与工程学院，山东 青岛，266000)

酸奶是以嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌为主要菌种发酵而成的乳制品，因其独特的风味和丰富的营养吸引了大批消费者[1]。然而，酸奶在储运过程中，菌体会利用残存乳糖继续发酵产生过度酸味，影响酸奶质量，即后酸化现象。为缓解酸奶后酸化现象，目前的措施主要有诱变育种[2]、调节发酵菌株比例[3]、补充抗菌物质[4]等。诱变育种操作复杂，难以维持稳定性状，突变菌株的安全性无法保障[5]。调节发酵菌株比例虽然对解决后酸化有一定效果，但在实际工业操作过程中很难保持各批次产品接种量的一致性[3]。Nisin是是一种应用广泛的细菌素[6]，添加Nisin可以有效缓解酸奶的后酸化，但是Nisin抑菌谱窄，在使用过程中需要与其他防腐剂结合[7]，增加了企业生产成本[8]。如何有效延缓后酸化同时减少企业成本，是目前研究热点。

随着相关研究的不断深入，有研究表明在酸奶中接种辅助菌株不仅可有效缓解后酸化，而且可以改善酸奶的感官品质。尚楠等[3]发现在酸奶中接种产细菌素双歧杆菌L-SN能有效抑制酸奶的后酸化，并能显著提高酸奶的持水力和黏度，改善酸奶品质。其木格苏都[9]发现在发酵乳中接种益生菌LactobacilluscaseiZhang可以赋予产品较好的质构和风味。本实验室前期从我国传统发酵食品中筛选获得一株产细菌素的植物乳杆菌LactobacillusplantarumQ7，对革兰氏阳性和革兰氏阴性食品腐败菌(李斯特菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、荧光假单胞菌、沙门氏菌等)均具有抑制作用[10]。本研究通过在酸奶原有菌株的基础上接种不用剂量的植物乳杆菌L.plantarumQ7共同发酵，探究其对酸奶后酸化及酸奶品质的影响，以期开发一种缩短发酵时间，缓解酸奶后酸化，延长货架期的新型酸奶辅助发酵菌株。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌种与培养基

L.plantarumQ7，中国海洋大学食品科学与工程学院功能性乳品与益生菌工程研究室提供。保加利亚乳杆菌Lactobacillusbulgaricusinm25，嗜热链球菌Streptococcusthermophilusinm25，江苏微康生物科技有限公司。

1.1.2 主要实验材料

脱脂乳粉、白砂糖。

1.1.2 主要仪器与设备

SW-CJ-1D型净化工作台，苏州泰安空气技术有限公司；iCinac型酸化监控仪，法国AMS公司；APV-2000型高压均质机，斯比克公司；TMS-PRO型质构仪，美国FTC公司；TG20KR-D型高速冷冻离心机，长沙东旺实验仪器有限公司；LDZX-75KBS型全自动灭菌锅，上海申安医疗器械厂；GHP-9050型隔水式培养箱，上海慧泰仪器制造有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 植物乳杆菌Q7对保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌生长的影响

取10 μL活化的指示菌菌液接种于培养基中，并将含有指示菌的半固体培养基倒入含牛津杯的平皿上，待培养基凝固后，取出牛津杯，向孔洞中加入150 μLL.plantarumQ7发酵液，在4 ℃冰箱中水平静置1 h，之后置于37 ℃培养。12 h后观察抑菌圈，抑菌圈直径用游标卡尺测量[11]。

1.2.2 植物乳杆菌Q7合成细菌素时效性测定

将活化好的植物乳杆菌Q7以2%(体积分数)的比例接种到MRS培养基中，37 ℃下培养14 h，每2 h取发酵液离心获取上清，8 000 r/min离心5min，除去菌体。上清液用5 mol/L的NaOH调至pH 6.0～6.5，0.22 μm滤膜过滤，-20 ℃保存备用。参照1.2.1进行抑菌圈测定。

1.2.3 酸奶制备

将脱脂乳粉(添加量110 g/L)加入蒸馏水加热搅拌，待温度升至55 ℃时，加入蔗糖(添加量80 g/L)并搅拌均匀；均质(60 ℃，20 MPa)后将样品分装，95 ℃高温灭菌10 min，冷却到42 ℃接种发酵剂，恒温发酵至pH接近4.5时，停止发酵， 4 ℃冷却后熟。

1.2.4 试验设计及分组

试验设置3组酸奶，按接种比例划分为对照组、L.plantarumQ7低剂量组、L.plantarumQ7高剂量组。对照组为嗜热链球菌(5×106CFU/mL)和保加利亚乳杆菌(5×106CFU/mL)接种比例1∶1；L.plantarumQ7低剂量组为嗜热链球菌∶保加利亚乳杆菌∶L.plantarumQ7接种比例1∶1∶1；L.plantarumQ7高剂量组为嗜热链球菌∶保加利亚乳杆菌∶L.plantarumQ7接种比例1∶1∶2。发酵期间每10 min测定pH，在4 ℃贮藏期间每隔3 d测定pH、可滴定酸度，总活菌数、析水率。

1.2.5 酸度的测定

pH测定：采用iCinac型酸化监控仪进行pH测定。

可滴定酸度：参考GB 5009.239—2016[12]。

1.2.6 活菌数的测定

根据GB 4789.2—2016[13]中菌落总数测定的方法，利用菌落平板计数法测定活菌数。

1.2.7 析水率的测定

称取20 g样品，1 000 r/min离心10 min，称取沉淀质量，按公式(1)计算析水率[14]：

(1)

1.2.8 质构测定

使用TMS-PRO型质构仪采用两次咀嚼测试程序(texture profile analysis，TPA)对酸奶进行质构分析[15-16]。参数设置如下：力量感应源ILC/500 N，底部类型为直径50 mm圆柱形探头，形变百分量35%，检测速度60.0 mm/min，触发力0.75 N。

1.2.9 感官鉴评

根据中国乳制品工业行业规范RHB 103—2004《酸牛乳感官质量评价细则》[17]，选取10位经过感官鉴评培训的食品专业的学生作为鉴评小组(男女比例为1∶1)，从色泽、滋味和气味、组织状态3个方面对3组酸奶进行感官鉴评。采取百分制，其中色泽、滋味和气味、组织状态分别占10分、40分、50分。

1.2.10 数据分析

试验设置3组平行，结果表示为平均值±标准差。采用SPSS 22.0软件对试验数据进行差异显著性分析(P<0.05)。相同字母表示无显著差异，不同字母表示差异性显著。

2 结果与分析

2.1 植物乳杆菌Q7对保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌生长的影响

L.plantarumQ7对保加利亚乳杆菌及嗜热链球菌的生长影响如图1。

图1 L. plantarum Q7对保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的生长影响Fig.1 Effects of L. plantarum Q7 on the growth ofL. bulgaricus and S. thermophilus

L.plantarumQ7对保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的生长繁殖均有一定的抑制作用，对保加利亚的抑制作用大于对嗜热链球菌。有研究表明，保加利亚乳杆菌是导致后酸化的主要菌株[18]。如果能在酸奶贮藏期间抑制保加利亚乳杆菌生长，可以达到延缓后酸化的作用。该抑菌效果是在MRS培养系统中进行，L.plantarumQ7在牛乳中对保加利亚乳杆菌及嗜热链球菌的生长是否有类似的影响有待进一步研究。

2.2 L. plantarum Q7合成细菌素时效性及其对酸奶发酵的影响

42 ℃恒温发酵过程中每10 min测定1次pH，3组酸奶均在3.5 h内完成发酵，其中对照组的酸奶在3.45 h到达发酵终点(pH=4.5)。接种L.plantarumQ7的2组酸奶在发酵过程中pH均偏低，高剂量组酸奶pH最低，2组酸奶在3.2 h到达发酵终点，缩短发酵时间15 min。L.plantarumQ7细菌素产量变化如图2所示，发酵初期细菌素产量缓慢增长，4 h以后细菌素产量迅速增长；酸奶发酵时间在3.5 h内，表明在酸奶发酵期间细菌素的产量较少，不足以抑制保加利亚乳杆菌及嗜热链球菌的生长，且3种菌株能协同发酵产酸，加快了产酸进程，缩短了发酵时间。在酸奶贮藏期，L.plantarumQ7合成细菌素对保加利亚乳杆菌及嗜热链球菌具有一定抑制作用，达到缓解后酸化的效果。

图2 L. plantarum Q7合成细菌素时效性及其对酸奶发酵的影响Fig.2 Aging effect of L. plantarum Q7 on bacteriocinsynthesis and its effect on yogurt fermentation

2.3 植物乳杆菌对酸奶后酸化的影响

2.3.1 酸奶贮藏过程中pH 的变化

酸奶4 ℃冷藏22 d，pH变化如图3所示。3组酸奶pH在冷藏期间均呈下降趋势，其中L.plantarumQ7低剂量组酸奶pH下降最为平缓，且在冷藏期间的pH均高于其他2组。酸奶pH是评价酸奶品质的一个重要指标，一般酸奶的pH在4.2～4.5之间[19]，低剂量组的酸奶在冷藏期间pH均在此范围中，而对照组酸奶从第13天开始，pH低于4.2，这与尚楠等[3]的研究结果一致，说明贮藏期间L.plantarumQ7的细菌素产量能够抑制保加利亚乳杆菌及嗜热链球菌的生长，但不会影响酸奶的酸度。高剂量组酸奶从第4天开始pH低于4.2，可能是因为高剂量的L.plantarumQ7产酸过度导致，表明接种L.plantarumQ7可以在一定程度上缓解酸奶后酸化，但是与L.plantarumQ7呈现剂量依赖性。

图3 酸奶贮藏过程中pH的变化Fig.3 Change of pH value of yoghurt during storage

2.3.2 酸奶贮藏过程中可滴定酸度的变化

3组酸奶在冷藏期间可滴定酸度变化如图4。3组酸奶的酸度在前19 d均呈升高趋势，第22天酸度下降，主要因为酸奶中的活菌继续利用乳糖产酸所致[3]。低剂量组酸奶可滴定酸度在3组酸奶中最低，可能是L.plantarumQ7细菌素产量达到了抑制其他菌株活性的效果，但不会过度抑制。有研究报道，酸奶的最佳酸度为80～120°T[20-21]，3组酸奶的酸度均在此范围内。低剂量组酸奶酸度在冷藏期间一直低于对照组，表明低剂量L.plantarumQ7可以减缓酸奶酸化程度。

图4 酸奶贮藏过程中可滴定酸度的变化Fig.4 Change of acidity of yoghurt during storage

2.3.3 酸奶贮藏过程中活菌数的变化

3组酸奶在贮藏过程中活菌总数变化如图5。随着贮藏时间的延长，酸奶中的总活菌数呈下降趋势，在第7天高剂量组活菌数急剧下降，可能是高剂量组产生的细菌素对其他菌株的生长起到一定程度的抑制作用，导致菌落总数下降。在第7天以后菌落总数变化保持平缓的状态，第22天仍保持1×108CFU/mL，可能在这些菌大部分由L.plantarumQ7组成，贮藏后期L.plantarumQ7繁殖成为优势菌。低剂量组酸奶与对照组酸奶活菌数变化趋势基本一致，表明低剂量L.plantarumQ7对酸奶总活菌数的影响并不明显。

图5 酸奶贮藏过程中各组菌落总数的变化Fig.5 Change of viable cells during storage

2.3.4 酸奶贮藏过程中析水率的变化

析水率越高说明酸奶乳清析出越多，凝固性越差。3组酸奶在贮藏过程中的析水率变化如图6。3组酸奶的析水率随着时间延长总体变化不规律，但是变化趋势基本一致。3组酸奶从第1天～第4天析水率上升，第4天各组的析水率均达到最大值，从第4天到第16天酸奶析水率整体呈下降趋势，而从16 d以后，析水率大幅回升。酸奶析水率的变化与蛋白水解酶有关，乳酸菌分泌的蛋白水解酶随着贮藏时间的延长而增加，进而影响酸奶的析水率[22]。3组酸奶的变化趋势一致，表明L.plantarumQ7对酸奶析水率变化没有明显影响。

图6 酸奶贮藏过程中析水率的变化Fig.6 Change of water-discharging rate of yoghurt duringstorage

2.3.5 质构检测

对3组酸奶进行质构检测，结果如表1。L.plantarumQ7高剂量组酸奶硬度、黏附性、内聚性、弹性、胶黏性和咀嚼性与对照组均无显著差异，而低剂量的L.plantarumQ7可以显著降低酸奶的硬度(P<0.05)，显著提高酸奶的内聚性(P<0.05)，对其他4种指标无显著影响。影响酸奶硬度的因素较多，如原料乳成分、牛乳处理方式、酸度等[23]。3组酸奶的原料及加工过程一致，冷藏过程中低剂量组酸奶酸度最小，高剂量组与对照组的酸度酸度偏高。因此酸度可能是影响L.plantarumQ7低剂量组与对照组硬度的差异因素，酸度越小，蛋白质水合作用减弱，硬度越小。酸奶硬度决定了酸奶的咀嚼口感[24]，硬度偏小的酸奶口感偏柔软。酸奶内聚性受到酸度、持水性及蛋白结构等因素的影响。接种L.plantarumQ7可能会影响酸奶的酸度和蛋白结构，进而导致乳蛋白之间的交互作用及乳凝胶的内部键加强，因此内聚性提高[25]。低剂量L.plantarumQ7组酸奶具有柔软口感和较强内聚性。但L.plantarumQ7对酸奶内聚性的影响原因有待进一步探究。

表1 酸奶质构分析结果Table 1 Results of texture analysis of yoghurt

注：字母不同表示差异显著，P<0.05

2.3.6 感官鉴评

为研究L.plantarumQ7对酸奶的感官品质的影响，对3组酸奶进行感官鉴评，评分结果如表2所示。L.plantarumQ7低剂量组和高剂量组酸奶的色泽、滋味和气味、组织状态评分均显著高于对照组，其中低剂量组酸奶感官评分最高，表明低剂量L.plantarumQ7可以使酸奶风味更佳，这与低剂量L.plantarumQ7可以延缓后酸化、改善酸奶的质构的结果相一致。

表2 酸奶感官鉴评结果Table 2 Results of sensory evaluation of yoghurt

3 结论

研究了产细菌素L.plantarumQ7对酸奶后酸化及酸奶的质构、感官品质的影响。L.plantarumQ7对保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的生长有一定程度抑制作用，且对后酸化主要产酸菌种保加利亚乳杆菌的抑制作用更强。低剂量L.plantarumQ7不仅可以缩短酸奶发酵时间，而且在酸奶贮藏期能够延缓后酸化。低剂量L.plantarumQ7可以显著降低酸奶硬度，提高酸奶内聚性。低剂量L.plantarumQ7组酸奶感官评分和风味更佳。上述研究表明，L.plantarumQ7具有作为优良酸奶辅助发酵菌株的开发前景。