蜂蜜品种识别和掺假鉴别的研究进展

陈晓明 ，初叶心，乔江涛，张红城，张根生*

1. 哈尔滨商业大学（哈尔滨 150076）；2. 中国农业科学院蜜蜂研究所（北京 100093）

蜂蜜是一种被广泛食用的天然食物，主要是由糖类组成，也有其他成分，如酶、氨基酸、有机酸、类胡萝卜素、维生素、矿物质、芳香物质等。它含有丰富的黄酮类化合物和酚酸，具有广泛的生物学特性且可作为天然抗氧化剂[1]。现在吃蜂蜜的人群主要集中在老人、女性等群体，这些群体的共同特征是需要抗衰老、美容养颜，而具有抗氧化性且营养丰富的蜂蜜正好能供其所需。正是由于蜂蜜有利可图，市场上蜂蜜的掺假和掩盖植物源、地理源现象越来远严重。这不仅使市场价格混乱，损害消费者利益，也因为掺假蜂蜜和“赝品源”蜂蜜的流行对检测技术手段提出更高要求。

传统检测方法（如花粉鉴别、感官鉴别和理化指标鉴别）能在一定程度上鉴别蜂蜜真实性，但是存在局限性。同时由于蜂蜜是复杂的纯天然产品，产地来源千差万别，植物来源错综复杂，以及受采收季节、贮存、加工，甚者还有掺假的影响[2]，使得单花蜂蜜的溯源和掺假鉴别变得复杂。国内外利用仪器分析法与化学计量学相结合鉴定蜂蜜来源和掺假，对比传统检测方法，以减少在加工储存过程中蜂蜜由于内部组分变化而导致的误判。主要对仪器分析法进行客观评价，以期对未来蜂蜜品种鉴别和掺假鉴定提供建议。

1 花粉鉴别

蜂蜜花粉的表征和定量是确定花蜜来源和植物来源的传统方法，但很耗时，需要经验丰富的分析师并且强烈依赖于专家的能力和判断力。花粉粒的抗性外小孢子壁具有多种三维形状，使得植物物种能够被识别。常借助计算机工具帮助分类花粉类型。Kaya等[3]利用灰度共生矩阵（GLCM）纹理特征和人工神经网络（ANN）对10种不同植物来源的花粉进行估计，估计成功率达88.00%。

2 感官鉴别

蜂蜜的感官特征主要有颜色、香气、味道、黏度和绵性。这些感官特征容易在蜂蜜加工、贮存和结晶过程中受到影响。随着色素、糖浆和增稠剂的使用，蜂蜜的感官特征发生很大改变。同时感官鉴别是人为参与的，具有主观性。

3 理化指标鉴别

传统的理化指标检测是利用单个指标进行判断，但某些理化指标会在蜂蜜加工、贮存过程中发生改变，造成结果偶然性。为了对蜂蜜进行准确鉴别，现在往往利用多个理化指标并结合复杂的数学模型来达到鉴别目的。Popek[4]利用蜂蜜的3个主要物理参数（总灰分、总酸度和动态黏度）并结合判别分析对73种蜂蜜进行分类，正确率达到98.67%。岳锦萍等[5]利用几种理化参数鉴别蜂蜜与糖浆。结果显示，水分、果糖与葡萄糖质量分数比、蛋白质含量及分子质量可作为掺假鉴别指标。

4 仪器分析法

4.1 色谱技术

4.1.1 气相色谱及其联用技术

不同来源的蜂蜜具有明显不同的感官特性。特别是由于挥发性成分的巨大差别，香气差异更加突出。蜂蜜中挥发性化合物的组成取决于植物和地理来源、气候、土壤、蜂蜜的年龄、贮藏方式、蜂蜜加工和蜜蜂种类等多种因素。气相色谱-质谱联用技术（GCMS）特别适用于蜂蜜中挥发性或半挥发性化合物的测定。

Pattamayutanon等[6]采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术分析泰国4种单花和一种多花蜂蜜。结果显示每种泰国蜂蜜都具有复杂且独特的挥发性化合物分布，其种类和含量均与其他蜂蜜样品不同。Silva等[7]通过静态顶空气相色谱-质谱联用技术结合化学计量学方法，比较从巴西巴拉那州3个城市采集的8种无刺蜂蜜的挥发性成分，以区分Guaraqueçaba州的蜂蜜样品（正确预测率85.7%）、Cambará州蜂蜜样品（正确预测率80.0%）和Prudentópolis州蜂蜜样品（正确预测率100%）。Ruiz-Matute等[8]通过GC-MS检测蜂蜜中高果糖菊粉糖浆（HFIS）掺假情况。结果显示，所有真蜂蜜样品中均不含菊粉三糖和果糖二苷，而掺有HFIS的假蜂蜜中都含有菊粉三糖，从而确定菊粉三糖可作为高果糖菊粉糖浆掺入蜂蜜的标志物。

4.1.2 高效液相色谱及其联用技术

酚类化合物因其对人类健康的功能特性，尤其是抗氧化性而闻名。但在蜂蜜中，它们作为生化标志物具有另一重要作用，用于确定其地理和植物来源。酚类化合物含量受到花卉植物源和地理起源及气候特征的强烈影响，而加工、处理和储存对蜂蜜的酚类特征和组成影响轻微。高效液相色谱多用于蜂蜜中酚酸和黄酮含量测定。

Silic等[9]使用高效液相色谱-二极管阵列检测器（High Performance Liquid Chromatography-Diode Array Detector，HPLC-DAD）建立了不同蜂蜜的酚类谱，这些谱图可以作为蜂蜜植物来源的标记。Salas等[10]采用高效液相色谱法分析阿根廷不同地区蜂蜜中类黄酮含量，并表示杨梅素、槲皮素和木犀草素可作为蜂蜜地理起源的化学标志。周梦遥[11]利用高效液相色谱-电化学检测器（HPLC-ECD）结合化学计量学方法通过测定向日葵蜜中6种多酚化合物，建立掺入不同浓度大米糖浆的向日葵蜜指纹图谱。结果发现，聚类分析能够区分出加入30%以上大米糖浆的掺假蜂蜜，相似度分析只能检测到50%以上的掺假，2种方法灵敏度均较低。

4.2 光谱技术

4.2.1 核磁共振光谱

核磁共振技术（NMR）能够无损地检测含量在检出限内的所有小分子化合物。由于其无损特性，多种成分同时检测和高再现性等特点而被普遍接受。

Boffo等[12]用NMR结合PCA和HCA可以很好区分几乎所有蜂蜜，但对桉树和柑橘蜂蜜鉴别效果差。进一步对仅包括野花、桉树和柑橘蜂蜜的样品进行预测，KNN模型、SIMCA模型和PLS-DA模型给出不同的正确分类率。这表明用不同的化学分析模型得出的分类效果不尽相同。Zheng等[13]采用H-1核磁共振结合PCA和OPLS-DA能很好地区分福建、上海、浙江等地的洋槐蜂蜜样品。Bertelli等[14]使用一维（测1H数据）和二维（测1H-13C数据）核磁共振（NMR）与多变量统计相结合分析63份真蜂蜜样品和63份掺糖浆蜂蜜样品。结果显示，用一维光谱法结合留一法的交叉验证预测能力为95.2%，二维光谱法交叉验证正确分类率为90.5%。显然1H NMR序列更可取，因为它是最简单和最快的核磁共振技术。

4.2.2 红外（NIR）光谱

蜂蜜的主要成分有糖类、水分、酚类化合物、氨基酸和蛋白质，还有一些微量元素和花粉粒。检测这些物质，传统方法费时、费力。红外光谱技术拥有快速无损测定和具有较高的精确度等优势，可用于蜂蜜主要成分的定量检测。

谈爱玲等[15]利用傅里叶变换近红外光谱与核主成分分析（KPCA）和最小二乘支持向量机（LSSVM）相结合的方法对洋槐、益母草和黄连蜂蜜进行鉴别分类，正确率达96.67%。Chen等[16]采用NIR结合偏最小二乘模型正确分类100%纯蜂蜜和95%的掺高果糖玉米糖浆的假蜂蜜样品。Ruoff等[17]利用中红外光谱和LDA区分了来自德国和瑞士的5种蜂蜜。结果显示产地来源分类正确率达85%。

4.2.3 拉曼光谱

拉曼光谱是一种强大的分子光谱技术，可测量来自分子的非弹性散射光的波长和强度，从而实现快速和非破坏性的样品分析。拉曼散射的强度与分析物的浓度相关，这使得其能够进行定量分析。

Oroian等[18]应用拉曼光谱结合LDA对76个不同植物来源的蜂蜜样品进行分类，正确率达到83.33%。Pierna等[19]用傅里叶变换拉曼光谱（FT-Raman）结合偏最小二乘判别分析（PLS-DA）和支持向量机（SVM）区分来自法国、意大利、奥地利、德国和爱尔兰的科西嘉蜂蜜。这2个模型分类正确率的平均值在85%和90%之间。Li等[20]用拉曼光谱与PLS-LDA相结合检测蜂蜜中高果糖玉米糖浆（HFCS）和麦芽糖糖浆（MS）等杂质，鉴别区分准确度为91.1%（正宗蜂蜜与含HFCS的掺假蜂蜜），97.8%（正宗蜂蜜与含MS的掺假蜂蜜）和75.6%（正宗蜂蜜与含HFCS和MS的掺假蜂蜜）。

4.2.4 荧光光谱

蜂蜜的荧光特性主要归因于酚类和多酚类化合物，芳香族氨基酸和美拉德反应产物的存在。这些化合物的特征是结构中存在1个或多个芳环，这是荧光团的典型特征。蜂蜜的荧光特征更多取决于它们的植物来源而非地理来源[21]。

Ruoff等[22]用正面荧光光谱结合PCA和LDA对高山多花蜂蜜和单花蜂蜜（洋槐、高山玫瑰、蜜露、板栗和油菜）进行判别分析，平均正确率达94%。赵杰文等[23]应用三维荧光光谱技术结合化学计量学方法鉴别蜂蜜中大米糖浆掺假情况。结果显示，采用4个主成分时，模型对预测集样本的识别率最佳，LDA模型识别率达94.44%，反向传播人工神经网络（BPANN）模型识别率达100%，说明非线性的BP-ANN模型更适合蜂蜜掺假识别。

4.2.5 其他光谱技术

Necemer等[24]使用全反射X射线光谱结合PCA和冗余分析（RDA）通过分析矿物质元素区分斯洛文尼亚蜂蜜的植物源，确定在所有测定元素中，只有Cl、K、Mn和Rb这4种特征关键元素才能较好地鉴别蜂蜜类型。Liu等[25]应用太赫兹时域衰减全反射光谱结合化学计量学方法区分枸杞蜂蜜、荆条蜂蜜和洋槐蜂蜜。结果显示使用0.5～1.5 THz的PLS-DA模型获得88.46%准确度。Ansari等[26]使用紫外光谱和化学计量分析方法成功区分了从各种植物来源和地理位置采集的沙特阿拉伯蜂蜜样品。

4.3 人工智能感官技术

4.3.1 电子舌

电子舌是基于生物味觉模式建立起来的综合化学传感器和模式识别的液体分析仪器。

Rosa等[27]用电子舌和循环伏安溶出分析的融合，并结合判别因子分析（DFA）对蜂蜜分类，结果显示与单独使用电子舌的模型相比，识别率从70.8%提高到87.5%。Bougrini等[28]采用伏安电子舌（VE-tongue）结合化学计量法对18种蜂蜜进行分类。不仅成功区分了不同植物和地理来源的蜂蜜，而且在检测掺假蜂蜜方面也取得很好结果。PCA解释数据库中86.03%的信息与掺有葡萄糖糖浆的蜂蜜相对应，数据库中86.37%的信息对应于掺有蔗糖糖浆的蜂蜜。SVMs和HCA对掺入葡萄糖糖浆和蔗糖糖浆的样品，识别成功率都达到100%。

4.3.2 电子鼻

香气是食物感官特性中的一个重要参数。气相色谱和电子鼻都能用于蜂蜜中挥发性化合物的测定，但电子鼻拥有高灵敏度和与人体感官面板数据相关的优势，易于操作且成本低，只需要很短的时间便可分析。

Huang等[29]用电子鼻结合PCA和DFA通过确定蜂蜜主要品质成分，如葡萄糖，果糖，淀粉酶活性和酸度来鉴定蜂蜜的植物来源，并通过LS-SVM建立具有100%总体准确度的起源鉴别模型。Zuluaga-Domínguez等[30]使用电子鼻结合化学计量学开发一个人造神经网络，允许对不同地理来源的蜂蜜样品进行分类，成功率为81%。Zakaria等[31]比较电子鼻和电子舌结合LDA、PCA和概率神经网络（PNN）对18种不同蜂蜜样品（纯蜂蜜、纯糖浆和掺假样品）的分类能力。因为电子鼻和电子舌的数据性质非线性，所以非线性的PNN比线性的PCA和LDA表现更好。电子鼻和电子舌结合PNN分类正确率分别为92.59%和90.74%，电子鼻分类效果稍好。

4.4 差示扫描量热法

差示扫描量热（DSC）法是一种热分析方法。近年来也越来越多地用于蜂蜜品种检测，可以鉴定蜂蜜的植物源和掺假；虽然没有找到鉴定地理源方面的相关文献，但是蜂蜜的主要热力学性质如玻璃化转变温度与蜂蜜的天然水分含量之间有很强的相关性（r=-0.94）[32]，而蜂蜜含水量与地理源也有关系。因此，在蜂蜜中水分是天然、不经过浓缩且符合国际标准的情况下，通过DSC鉴定玻璃化转变温度可以实现对蜂蜜地理源的鉴别。

Tomaszewska-Gras等[32]使用DSC分析不同蜂蜜的玻璃化转变温度（Tg）。结果显示不同蜂蜜的Tg有明显差异（p＜0.05），从-49.7 ℃（多花蜜）到-34.8 ℃（向日葵蜜）不等。蜂蜜的结晶程度会影响Tg值，为获得可靠的DSC结果，在蜂蜜完全去结晶后测量Tg至关重要。Sobrino-Gregorio等[33]使用DSC评估10种向日葵掺假蜂蜜的热性质变化。玻璃化转变温度受糖浆种类的影响且与掺假浓度呈比例关系。除了龙舌兰、玉米和糙米糖浆外，其他糖浆随着浓度增加，样品的玻璃化转变温度随之降低。

4.5 稳定同位素技术

稳定同位素技术是指生物体内的同位素组成受自身代谢和外界环境等因素的影响，导致不同植物来源、地理来源的样品中同位素自然丰度出现差异，据此分类样品的来源。

对于溯源，陈辉[34]利用ICP-MS和IRMS联用分析中国不同地理来源和植物来源的253个蜂蜜样本。以稳定同位素比值为变量，PLS-DA方法建立的植物来源溯源模型的准确率优于BP-ANN方法，模型训练、交叉检验和预测的总体分类准确率范围为76.2%～83.4%。在地理来源溯源研究中，BP-ANN方法建立的模型的准确率则优于PLS-DA方法。对于掺假，季美泉等[35]通过EA/LC-IRMS法提出纯正蜂蜜δ13C值新要求：蜂蜜蛋白质与蜂蜜同位素差值δ13C P-H大于-0.097%；果糖、葡萄糖δ13C值之差δ13C F-G在-0.060～0.056%范围内；麦芽糖、蔗糖δ13C值之差δ13C M-S在-0.073～0.098%范围内；各个组分δ13C最大差值δ13Cmax小于0.205%。只要一项不符合，则被视为掺假蜂蜜。

4.6 DNA技术

随着分子遗传学的进步，基于DNA的一系列技术逐渐应用于鉴别蜂蜜植物源、地理源和掺假。

Utzeri等[36]从6种单花蜜、2种单花蜜和1种甘露蜜中提取DNA，并在叶绿体trnL-UAA条形码片段进行PCR扩增。利用离子流测序平台对得到的扩增产物进行测序。结果显示，6种单花蜂蜜中的5种证实预期的植物来源，只有椴树蜜未证实预期的植物学来源。同时指出代表甘露蜜的最强植物群是板栗属，单花和多花蜜的植物组成可用于推断其地理来源。Valentini等[37]用DNA条形码方法研究蜂蜜中的植物来源和地理来源。其中，利用一些特殊成分来判断蜂蜜的地理来源，如Athyrium vidalii。这种成分表明该蕨类植物分布于中国、日本和韩国等地，而且生长在阔叶林边缘或松树林的林下。Sobrino-Gregorio等[38]利用常规PCR产物的琼脂糖凝胶图像能检测到橘子蜜中水稻糖蜜的掺假。更进一步地，实时PCR与PLD1引物组合可区分橘子蜜和水稻糖蜜混合物中水稻DNA含量水平，通过标准曲线的构建可量化水稻DNA数量，从而更准确地估计掺假水平，结果显示可以检测到2%～5%水平的掺假。但该试验指出需要进一步确定该方法是否适用于检测蜂蜜中其他种类糖蜜，因为可能其他类型糖蜜对应物种的DNA不能提取。

5 结语与展望

由于蜂蜜本身的复杂性，且随着市场上蜂蜜来源混淆泛滥、掺假手段层出不穷且愈发高端，传统检测方法不能满足蜂蜜鉴别所需，如：花粉鉴别和感官鉴别具有主观性、不确定性等局限；理化指标鉴别对蜂蜜来源分类和掺假鉴别虽然有一定可行性，但是这些方法都是根据蜂蜜样品单一化学成分进行判断，而且和上述2种方法一样，都会受到采收、加工、贮存等影响。仪器分析法能最大限度减少传统检测方法的片面性和不准确性。要准确无误地鉴别蜂蜜来源和掺假在现阶段有一定难度。因此从3个方面对蜂蜜来源识别和掺假鉴别提出一些建议与展望。

（1）联合多种技术。对于掺假：虽然稳定碳同位素比率分析法是标准方法，但由于蜂蜜自身的复杂性和掺假手段的多样性，很难通过该技术检测组分间的δ13C差值保证检测结果的准确性，最好将碳同位素检测技术与色谱技术、光谱技术联合。

对于溯源：其他技术和DNA技术联用。尤其是红外光谱、核磁共振光谱、拉曼光谱等光谱技术具有快速无损检测优势，是未来发展的热门。然而，某些特殊情况如蜂蜜的挥发物、酚酸、糖和其他成分可能受到养蜂技术、环境条件和气候变化的影响，会导致结果不可靠。为克服这些问题，建议使用DNA标记物进行花粉识别可以作为辅助工具。

（2）化学计量学和仪器分析法做到有机结合。在实际鉴别工作中，单纯的仪器方法难以应对层出不穷的蜂蜜掺假和来源混淆。因此，需要借助化学计量学方法对所获得的数据进行处理，以提高准确率和实用性。

（3）构建蜂蜜数据库。从全国各地收集所有蜂蜜样品资料，详细整理每种蜂蜜在不同地域、季节表现出的性质（感官性质、理化性质和热力学性质）。加之分析每种蜂蜜的DNA图谱、色谱图、光谱图甚至稳定性同位素（2H、13C、15N、18O）等，再依靠计算机技术实现建模，为蜂蜜溯源和掺假鉴别提供参考。