三重基序家族蛋白在肺腺癌患者中的表达及其诊断意义

陈海斌 黎一山 武宇航 杨峰 麦惠强 李姝君

1中山市人民医院急诊科528403;2中山市人民医院呼吸内科528403;3中山市人民医院骨二科528403;4广州呼吸疾病健康研究院呼吸内科510120;5广东医科大学附属医院肿瘤一区,湛江524001

原发性肺癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,2014年我国发布的数据显示肺癌的新发病例居于恶性肿瘤首位[1]。在过去几十年,肺鳞癌是肺癌的主要组织学类型；近年来,随着环境的变化及吸烟人群结构的改变,肺腺癌发病率和病死率逐年升高[2]。三重基序家族蛋白72(tripartite motif family protein 72,TRIM72)是一种泛素连接酶,2013年《Nature》杂志报道TRIM72能诱导胰岛素抵抗引起代谢综合征[3],因此陆续有文章研究其与糖尿病的关系。2017年国内学者发现其在肝癌的迁移和侵袭中扮演着重要角色,有望成为肝癌基因治疗的重要靶点[4]。2018年国内学者发现其在结肠癌患者组织和血清中表达降低,且可以作为结肠肿瘤的诊断中起着重要作用[5]。最新体内试验显示抑制肺泡巨噬细胞TRIM72的表达可减轻肺部重症细菌感染[6]；既往也有文献提示TRIM72在肺部气道上皮细胞的损伤模型中起着保护作用[7-8],但其在肺部肿瘤中的表达尚未见报道。因此,本研究检测TRIM72在肺腺癌组织及外周血血清、胸腔积液中的表达,探索其与肺腺癌之间的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象 收集2017年8月至2018年2月广东医科大学附属医院呼吸内科、心胸外科和肿瘤科经电子支气管镜、改良性胸膜活检术、经皮CT引导下穿刺活检、转移性淋巴结活检或手术确诊的肺腺癌80例。其中,男45例,女35例；年龄(54.08±13.19)岁,年龄范围为22～75岁。以同时段20例健康体检者为对照组。留取39例肺腺癌伴胸腔积液患者及同时段15例炎性胸腔积液患者胸腔积液以检测胸腔积液TRIM72水平。肺腺癌病理诊断由2位经验丰富的病理学专家确诊,诊断标准符合2011年IASLC/ATS/ERS肺腺癌新分类标准[9]及2015版WHO肿瘤组织学分类标准[10]。肺癌TNM分期标准参考2009年肺癌TNM分期标准(第7版)。本研究通过广东医科大学附属医院伦理委员会批准(42378904),本研究还获得所有患者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 临床资料采集 记录年龄、性别、肿瘤TNM分期、临床分期等资料。

1.2.2 免疫组织化学检测 所有组织标本均使用10%甲醛固定后,梯度脱水并石蜡包埋后进行组织切片。组织切片经60℃烘箱烘烤3 h后,进行脱蜡与梯度乙醇水化,3%过氧化氢灭活内源性过氧化氢酶,在95～99℃下水浴抗原修复,恢复至室温后,使用BSA封闭20 min,滴加TRIM72抗体(上海艾博抗贸易有限公司)后4℃孵育过夜,PBS洗涤,加辣根化氧化物酶标记的二抗工作液室温孵育40 min,PBS洗涤,DAB显色,苏木精复染,梯度乙醇脱水,中性树胶封片,出现棕黄色颗粒者判定为TRIM72阳性。

1.2.3 酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA) 采用TRIM72 ELISA检测试剂盒(上海鑫乐生物公司),按照说明书操作。使用ELISA Calc软件绘制标准曲线,拟合模型选用Logistic曲线(四参数)。

1.3 统计学分析 采用SPSS 20.0软件进行数据分析,Graphpad Prism 6.0进行图形制作,Adobe Illustrator CS进行图片修饰。正态分布数据以±s描述,非正态分布数据以M(QR)描述。计量资料采用两独立样本t检验,计数资料采用χ2检验比较组间差异。非正态分布数据采用Mann-WhitneyU比较组间差异,采用Spearman相关确定数据相关性。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TRIM72在肺腺癌组织中的表达 TRIM72主要在正常肺组织中表达,而在肺腺癌癌旁气道组织中表达微弱,肺腺癌组织的间质中不表达(图1)。

2.2 TRIM72在肺腺癌患者外周血、胸腔积液中的表达 在外周血中肺腺组TRIM72水平较健康对照组低,癌性胸腔积液TRIM72水平明显低于炎性胸腔积液,差异均有统计学意义(t=8.73、10.09,P值均＜0.05),此外,肺腺癌患者外周血CEA、CA125水平高于对照组,癌性胸腔积液CEA、CA125水平高于炎性积液(P值均＜0.05),见图2。

2.3 临床资料及相关性分析 以血清TRIM72是否大于29.12 ng/L作为临界值进行临床信息比较[4]。对2组患者各个指标的分布进行卡方分析,发现2组患者在年龄、原发肿瘤大小、远处转移、临床分期及癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)水平方面比较均有统计学意义(P值均＜0.05)。分别对TRIM72与以上指标进行双变量相关性分析,TRIM72水平与年龄、原发肿瘤大小、远处转移、临床分期均无相关性(P值均＞0.05),而与CEA呈负相关性(r=-0.556,P＜0.001)。此外,TRIM72水平对性别、淋巴结转移分化程度、CA125水平的分布比较差异无统计学意义(表1)。

2.4 受试者工作特征曲线(receiver operating characteristics curve,ROC) 采用血清TRIM72、CEA、CA125等指标单独对肺腺癌诊断做ROC曲线,TRIM72低于110.629 ng/L、CEA高于4.535μg/L、CA125高于33.925 U/ml可分别作为诊断肺腺癌的cut-off值,曲线下面积分别为0.827、0.746、0.651,特异度及敏感度见表2。使用TRIM72分别联合CEA、CA125等指标做受试者工作曲线,曲线下面积明显升高(表3)。其中TRIM72同时联合CEA及CA125曲线下面积可达到0.934。

图1 TRIM72在不同组织中的表达 免疫组织化学法 ×200 A:正常气道组织；B:癌旁气道组织；C:肺腺癌组织

图2 TRIM72、CEA、CA125在肺腺癌患者外周血、胸腔积液中的表达

表1 不同水平外周血TRIM72的肺腺癌患者的临床特征[ng/L,例(%)]

表2 TRIM72、CEA及CA125诊断肺腺癌的AUC与cut-off值

表3 TRIM72与CEA、CA125联合诊断肺腺癌的AUC

3 讨论

肺癌是我国病死率和死因居于首位的恶性肿瘤,严重危害人类健康。近二十年来,肺腺癌的发病率逐年升高。肺癌起病隐匿,大多数患者就诊时已是中晚期。同时,因肺腺癌组织内血管丰富,淋巴结和血行转移早,进展快,导致预后不佳。因此寻找理想的肿瘤标记物用于诊断、治疗将有较高的临床价值。

TRIM72又称MG53,是由144个氨基酸组成的相对分子质量为53 000的一个小分子蛋白。TRIM72由一个指环结构,一个B-Box和一个卷曲螺旋组成[11]。TRIM72是三基序蛋白家族成员之一,TRIM蛋白家族结构保守,进化较快,现已发现超过70种家族成员,且多个家族成员与肿瘤发生、发展相关[12]。目前国内外关于TRIM72研究较少,已有的研究表明TRIM72能促使受损肌细胞膜的修复[13],调节心肌细胞,对心肌有保护功能[14]。近年研究发现,TRIM72能诱导胰岛素抵抗及代谢综合征[3]。TRIM72可以直接或间接地调节胞腔内吞,通过去除质膜创伤参与肺泡上皮细胞修复[15]。2018年有学者发现吸入TRIM72可以减轻肺部通气损伤[16],另外有国内学者发现TRIM72在结肠癌的诊断中起着重要作用,TRIM72明显降低可提示结肠肿瘤的发生[5]；而结肠癌最常见的组织类型就是腺癌。因此,我们推测TRIM72可能与结肺腺癌发生、发展相关。

本研究首先使用组织切片经免疫组织化学染色进行验证。结果显示TRIM72在肺腺癌组织中的表达明显低于癌旁正常组织,主要在癌旁气道上皮组织间质中表达,而在肺腺癌组织中不表达；这提示TRIM72在正常组织中起着保护性作用,而在肿瘤组织中TRIM72受到微环境的抑制而表达下调,该结果与既往研究TRIM72在结肠肿瘤得出结论相似[5],这提示TRIM72可能在肿瘤微环境中发挥作用。查阅文献发现,TRIM72可以调节大鼠心肌纤维细胞的增殖和迁移[17],在外周血血清中可作为心肌损伤标志物[18],说明TRIM72可分泌到外周血中进行相关检测。因此,我们收集健康人与肺腺癌患者外周血血清检测TRIM72水平,发现在外周血血清中,肺腺癌患者TRIM72水平低于健康人且差异具有统计学意义,这与免疫组织化学结果相一致。参考既往文献[4],本研究采用TRIM72是否高于29.12 ng/L对临床资料分析。TRIM72水平与肺腺癌远处转移相关,且TRIM72在正常气道上皮组织或癌旁气道上皮组织间质中表达,结合既往文献认为TRIM72在肺气道上皮损伤中起着保护作用[7,13,16],我们推测TRIM72在正常组织中起着保护作用,而在肿瘤微环境中由间质细胞分泌,表达明显减少,与肿瘤转移相关。同时,TRIM72水平与肺腺癌患者的年龄、原发肿瘤大小、临床分期及CEA水平存在相关性,而与性别、分化程度、CA125水平无相关性,这也提示了TRIM72在肺腺癌的发生、发展中扮演着一定角色。

在过去的几十年,关于肿瘤生物标记物的探索一直在进行着,然而针对肺癌的生物标记物其特异度及敏感度仍未能同时兼顾。本研究发现TRIM72水平降低与肿瘤的远处转移及临床分期相关,因此,我们推断血清TRIM72是否可以作为肺腺癌的肿瘤标记物用于临床诊断。使用各指标单独做ROC曲线,发现外周血TRIM72低于110.629 ng/L可提示肺腺癌的发生,曲线下面积达到0.827。而外周血CEA高于4.535μg/L、CA125高于33.965 U/ml曲线下面积分别只有0.746和0.651。TRIM72联合CEA、CA125的ROC曲线下面积可达到0.934,这些数据表明TRIM72可能成为肺腺癌的新的肿瘤标志物。本研究显示TRIM72主要表达在正常气道上皮组织及间质中,而在肿瘤组织中表达降低或缺失；同样在健康人外周血血清中TRIM72水平明显高于肺腺癌患者,且TRIM72水平与肿瘤的远处转移、病理分期及CEA水平相关。综上所述,我们认为TRIM72可能作为肺腺癌诊断的生物标记物,与肺腺癌的发生、发展及预后相关；其可能在肿瘤中作为负向调控因子存在,且与远处转移相关。但具体机制尚不清楚,需要进一步研究得以明确。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突