非小细胞肺癌中Pokemon蛋白与P14ARF-MDM2-p53通路蛋白的相关性研究

2020-02-25王丽红窦亚平韩双双许浩然王嘉

国际呼吸杂志 2020年4期

王丽红窦亚平韩双双许浩然王嘉

1河北医科大学第一医院呼吸内科,石家庄050031;2河北医科大学第一医院内镜中心,石家庄050031;3承德市中心医院呼吸内科067000

流行病学资料显示,全球和中国的肺癌发病率和病死率均位居首位,严重威胁人类生命健康[1-2]。肺癌根据病理类型的不同,分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)两大类。NSCLC主要包括鳞状细胞癌、腺癌、大细胞癌等,占所有肺癌病理类型的85%[3]。目前认为,肺癌的发病原因在于各种致癌因素引起细胞基因组DNA损伤、癌基因的激活以及抑癌基因的失活,是多基因、多因素相互作用的结果[4]。Pokemon基因为转录抑制因子POK家族成员之一,作为致癌剂促进乳腺癌[5]、膀胱癌[6]及口腔鳞癌[7]等多种肿瘤的发生和发展进程。Agrawal等[8]研究推测,Pokemon通过调节P14ARF-MDM2-p53通路促进乳腺癌的发病。当前,NSCLC发病过程中,Pokemon和P14ARFMDM2-p53通路的作用及相互关系尚未明确,值得进一步探讨。本研究采用免疫组织化学法检测NSCLC中的Pokemon蛋白及P14ARF-MDM2-p53通路蛋白表达情况,分析各指标间相关性及与临床病理资料间的关系,为NSCLC的发病机制研究提供依据。

1 对象与方法

1.1 一般资料纳入2015年10月至2016年10月河北医科大学第一医院行手术治疗的35例NSCLC患者(术前均未进行化疗或放疗,均符合2011年第1版美国国家综合癌症网络非小细胞肺癌指南诊断标准[9])为NSCLC组。其中,男26例,女9例；年龄(60.71±9.20)岁,年龄范围为44～74岁；鳞状细胞癌23例,腺癌12例；低中分化25例,高分化10例；伴有周围淋巴结转移22例,无周围淋巴结转移13例；TNM分期Ⅰ期和Ⅱ期23例,Ⅲ期和Ⅳ期12例。同时,将癌旁正常支气管断端组织29例及肺炎组织25例分别作为支气管对照组和肺泡对照组,全部组织标本均由2位高年资病理主任医师分别诊断证实。本研究获得患者知情同意及河北医科大学第一医院伦理委员会的批准(2016026)。

1.2 主要试剂兔多克隆抗体Pokemon和小鼠单克隆抗体MDM2、p53均购自英国Abcam公司,工作浓度分别为1∶200,1∶300,1∶300。兔多克隆抗体P14ARF购自沈阳万类生物科技公司,工作浓度为1∶200。免疫组织化学染色试剂盒和浓缩型DAB试剂均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 试验方法检测方法采用SP免疫组织化学法。常规石蜡包埋切片,将待检测切片放入恒温烤箱,60～65℃过夜,柠檬酸缓冲液煮沸修复,严格按照免疫组织化学试剂盒说明书步骤进行,DAB显色,苏木素复染,中性树胶封片,显微镜下观察结果。染色阳性判定以细胞核或细胞质内出现棕黄色或黄色颗粒,其中以细胞核为着色部位的为MDM2和p53,以细胞质为着色部位的是Pokemon、P14ARF。所有免疫组织化学结果均设立阴性与阳性内对照。所有结果判定均由2位高年资病理主任医师分别独立完成,阳性判定以阳性细胞数占所观察细胞总数百分比及染色强度综合计算,阳性细胞数占所观察细胞总数百分比:＜5%为0分,≥5%且＜25%为1分,≥25%且＜50%为2分,≥50%为3分；染色强度:不着色为0分,淡黄色为1分,棕黄色为2分,棕褐色为3分。每张病理切片随机选取5个400倍视野,两项评分相加,≤3分判定为阴性,＞3分判定为阳性。

1.4 统计学分析采用SPSS 21.0软件进行统计学处理。计数资料以例数(%)表示,组间比较采用χ2检验；分析临床病理资料时因n＜40,结果采用Fisher确切概率法；相关性分析应用Spearman相关性检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Pokemon蛋白及P14ARF-MDM2-p53通路蛋白在3组间表达情况 Pokemon蛋白、MDM2蛋白、p53蛋白在NSCLC组中的表达均显著高于肺泡对照组和支气管对照组(χ2=32.93、25.93、22.98,P值均＜0.01),P14ARF蛋白在NSCLC组中的表达显著低于肺泡对照组和支气管对照组(χ2=25.39,P＜0.01),见表1、图1～4。

2.2 NSCLC组中Pokemon、P14ARF、MDM2和p53蛋白的表达与临床病理资料之间的关系Pokemon和P14ARF蛋白表达与NSCLC患者的性别、年龄、肿瘤直径、分化程度、组织类型、淋巴结转移和TNM分期均无关(P值均＞0.05)。NSCLC组中MDM2和p53蛋白表达与肿瘤的分化程度相关,其在肺癌低中分化的阳性表达显著高于高分化(P=0.03、0.02),而与患者的性别、年龄、肿瘤直径、组织类型、淋巴结转移和TNM分期均无关(P值均＞0.05),见表2。

2.3 Pokemon蛋白与P14ARF-MDM2-p53通路蛋白的相关性在NSCLC组中,Pokemon与P14ARF蛋白的表达呈负相关性(r=-0.58,P＜0.01),P14ARF与MDM2蛋白的表达呈负相关性(r=-0.51,P＜0.01),MDM2与p53蛋白的表达呈正相关性(r=0.86,P＜0.01)。

3 讨论

人类原癌基因Pokemon为POK红系髓性致癌剂,定位于19p13.3,全长为21.6 kb,位于多种原癌基因和抑癌基因的上游,在基因转化过程中起关键作用[10-11]。P14ARF基因位于9p染色体短臂上的CDKN2a位点,由3个外显子构成,是一个调控细胞周期的抑癌基因,编码P14ARF蛋白[10]。原癌基因MDM2定位于12号染色体,编码的MDM2蛋白能扰乱细胞周期的调控,影响肿瘤细胞增殖和凋亡,导致肿瘤的发生[12-13]。p53位于17号染色体,其基因产物有野生型和突变型2种,野生型p53发挥抑癌作用,而突变型p53具有促癌作用[14]。MDM2与p53的变化具有一定的同向性,高水平的p53-MDM2复合物具有较强的致癌活性,在肿瘤的发生和发展中发挥重要作用[15-16]。文献报道,Pokemon可直接结合P14ARF启动子抑制其转录活性、激活P14ARF-MDM2-p53通路,在一些肿瘤中发挥致癌剂的作用[10,17]。

鳞状细胞癌和腺癌是NSCLC的2种主要病理类型,发生于支气管黏膜上皮、腺体和肺泡上皮,由于肿瘤的起源不同,可能存在着不同的癌变机制。本研究NSCLC组中包括鳞癌和腺癌,故特设支气管对照组和肺泡对照组分析Pokemon、P14ARF、MDM2和p53蛋白在组间的表达情况,以增加试验的准确性和可靠性。本研究结果示Pokemon蛋白表达在NSCLC组中显著高于支气管对照组和肺泡对照组(P＜0.01),表明Pokemon蛋白在NSCLC发病过程中起致癌剂的作用。有文献报道,Pokemon在乳腺癌[5]、肾癌[18]、前列腺癌[19]、结直肠癌[17]等肿瘤中高表达,结合本研究结果表明Pokemon在多种恶性肿瘤中发挥促癌作用。Zhao等[20]发现,Pokemon的表达水平与NSCLC TNM分期有关。姜海斌等[21]研究表明,Pokemon蛋白表达与食管鳞癌分化程度、淋巴结转移、TNM分期均明显相关。本研究结果示Pokemon蛋白与NSCLC的分化程度、淋巴结转移及TNM分期有表达差异趋势,但差异无统计学意义,与前述两项文献结果不符,分析原因可能为本组样本量小有关,后期会加大样本量进一步研究。

本研究发现P14ARF蛋白在NSCLC组中低表达,MDM2与p53蛋白在NSCLC组中高表达,与支气管对照组和肺泡对照组比较差异有统计学意义,表明在NSCLC中P14ARF蛋白起抑癌作用,MDM2与p53蛋白发挥促癌作用。Seo等[22]和Li等[23]的研究表明,P14ARF蛋白可直接结合MDM2并抑制其对p53的降解,从而诱导G1期和G2期限制点的停顿；当关闭p53-MDM2负反馈环路,直接抑制MDM2转录,使得p53迅速积聚,启动基因的修复和细胞凋亡。结合本研究结果推测,在NSCLC的发病过程中,P14ARF-MDM2-p53通路可能通过上述机制发挥作用。分析临床病理资料发现,MDM2和p53与NSCLC的肿瘤分化程度密切相关,二者蛋白在低中分化组阳性表达均显著高于高分化组(P值均＜0.05),提示MDM2和p53对NSCLC的预后判断有指导意义。Dong等[24]认为,MDM2过度表达与胰腺肿瘤细胞分化程度有关,与本研究结果相近。

表1 3组中Pokemon蛋白、P14ARF蛋白、MDM2蛋白、p53蛋白的表达[例(%)]

表2 Pokemon蛋白、P14ARF蛋白、MDM2蛋白和p53蛋白与临床病理资料之间的关系[例(%)]

相关性分析结果示NSCLC组中Pokemon蛋白与P14ARF蛋白表达呈负相关性,P14ARF蛋白与MDM 2蛋白呈负相关性,MDM 2蛋白与p53蛋白呈正相关性,提示在NSCLC发病过程中,Pokemon可负向调节P14ARF蛋白表达,推测其通过P14ARF-MDM2-p53通路发挥致癌作用。文献报道,Pokemon可特异地结合于P14ARF启动子区域,是P14ARF的特异阻遏物,而P14ARF直接结合MDM2,进而参与p53途径影响淋巴瘤的发生、发展[10],间接佐证了本研究结论。