儿茶素调控MAPK通路改善幼鼠过敏性气道炎症反应的机制研究

张小华 朱小辉

湖北省天门市第一人民医院儿科431700

过敏性哮喘为临床多见慢性炎症性疾病,支气管哮喘(哮喘)患者起病与进展中其体内炎症反应有重要影响,可能为哮喘发病机制之一[1]。全世界范围内约有近20%的人曾患过敏性疾病,对人们的生活质量造成了一定影响[2]。过敏性哮喘主要发病人群为儿童群体,相关研究显示,我国儿童哮喘发病率在3.3%左右,且有逐年升高趋势[3]。当前,临床上治疗哮喘的药物对患儿临床症状控制效果并不理想,若患儿长时间采用糖皮质激素则会影响到其生长发育[4]。因此,探究过敏性哮喘对患儿的影响及相关机制,积极寻求有效且不良反应少的药物有重要临床价值。我国已有数千年的饮茶文化,茶叶已成为人们日常生活中主要保健品之一。儿茶素最初是从茶叶内取的,为茶叶内含黄铜类成分最多化合物,具有抗炎、抗氧化等多种药理活性[5]。因此,本研究经过分析儿茶素调控丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路改善幼鼠过敏性气道炎症反应的机制,为临床患儿诊疗提供一些借鉴。

1 资料与方法

1.1 实验小鼠 选取SPF级BALB/c纯系小鼠50只,4周龄,购自北京维通利华实验动物公司,许可证号:SCXK(京):2019-04,体质量(18.27±1.10)g,体质量范围为15～20 g。常规饲养1周后开始实验,小鼠分笼饲养,每个笼内5只,室温维持在22℃～26℃,相对湿度为55%～65%,昼夜循环,保持12 h光照,小鼠灌胃、添加饲料及换水等都由专人进行。

1.2 实验药物、试剂与仪器 地塞米松磷酸钠注射液购自白云山天星制药公司(规格:1 mg∶5 mg),儿茶素购自江西海富生物公司(纯度＞90%),IL-4、IL-5及IL-13试剂盒购自南京建成生物研究所,乱蛋白冻干粉购自美国Sigma公司(规格:10 mg/支),鼠源p-p38MAPK、细胞外信号调节激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)、p38MAPK及p-ERK单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司。

电热恒温鼓风干燥箱(型号:DHG-9023A)、数字显示隔水式电热恒温培养箱(型号:PYXDHS)、漩涡混合器(型号:XW-80A)、离心机(型号:TGL-168)均由美国KIMBLE公司生产,PCR扩增仪由美国PE公司生产(型号:PE9600)。

1.3 研究方法 根据随机数字表法分成5组,分别为模型组、正常组、阳性对照组、儿茶素低剂量组及儿茶素高剂量组,每组各10只。除正常组外,其他各组小鼠在第1、8天时将0.2 ml混悬液(氢氧化铝粉末1 mg+乱蛋白冻干粉0.2 mg)注入腹腔,当做首次致敏；在第15天将小鼠放置在超声雾化器内,对小鼠喷洒1%的乱蛋白冻干粉生理盐水以激发其发作哮喘,20 min/次,隔日1次,共激发10次。成功激发标志为小鼠出现站立不稳或者点头呼吸、口唇发绀、呼吸加快及腹肌痉挛等表征。依据人与动物剂量转换,成功造模后阳性对照组小鼠灌胃剂量为0.5 mg/kg的地塞米松药液,儿茶素低剂量组及儿茶素高剂量组分别灌胃剂量为1 mg/kg、2 mg/kg儿茶素药液,模型组和正常组灌胃等剂量生理盐水,每日1次,连续灌胃28 d。

1.4 观察指标 (1)观察小鼠一般情况,并称取末次给药后各组小鼠体质量。(2)称重后小鼠腹腔注射剂量为0.8 ml/100 g的2.4%水合氯醛麻醉,剪开颈部毛发和皮肤,气管周边组织分离,作横行切口,行气管插管,将其右主支气管结扎,生理盐水灌洗左肺3次,支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)回收后离心半径8 cm,2 500 r/min离心10 min,弃掉上清液；选取沉渣重悬,吸取少许悬液放置在血细胞计数板下对细胞总数计数；BALF细胞涂片被Diff-Quik染色液染色后行分类细胞计数,包含嗜酸粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞及巨噬细胞。酶联免疫吸附试验检测小鼠BALF内IL-13、IL-5及IL-4含量,具体步骤依据试剂盒说明书进行。(3)选取小鼠右支气管平滑肌,缓冲液将冲洗,10%甲醛固定,而后行酒精梯度脱水、透明,石蜡包埋后切片,厚度为4μm,常规行HE染色,观察其病理组织形态。(4)蛋白质免疫印迹检测小鼠肺组织内p-p38MAPK、ERK、p-ERK及p38MAPK蛋白表达,选取肺组织研磨,经过组织裂解后上样电泳,起始电压80 V,溴酚蓝染料前缘进入到分离胶上缘后电压提升到100 V,溴酚蓝泳出分离胶下缘后电泳结束。半干电转移仪于PVDF膜内行蛋白质电转移,恒流为30 m A,连续90 min。PVDF膜取出后采用5%TBST脱脂奶粉封闭,震荡60 min。结束封闭后采用TNS-T漂洗液洗膜10 min,3次,把膜转移到杂交袋内,加入适量漂洗液稀释抗体,封口后在4℃下孵育过夜；TBST漂洗液洗膜10 min,3次,在加入漂洗液稀释的辣根过氧化物酶标记二抗,震荡60 min。PVDF膜放置在ECL显色液内震荡温育5 min,暗室下曝光、显影及定影。清水冲洗以后,晾干扫描,IPP软件对扫描图像目的条带行灰度分析。(5)检测小鼠肺组织内p38MAPK、ERK m RNA表达,Trizol法提取小鼠右肺组织总RNA行RT-PCR扩增,p38MAPK正向引物:5'-GATTGAGATGATTTTGGAG-3',反向引物:5'-GTATGTTAAGTATATGATTG-3',扩增片段482 bp；ERK正向引物:5'-GCTCCAGGAATTCCTCGGTA-3',反向引物:5'-GAGTCCTGCATGCTAGCTAG-3',扩增片段389 bp；内参β-actin正向引物:5'-CTTGATCGTACGTAGCCTGA-3',反向引物:5'-GTGTAGTGTACTGTCATGCA-3',扩增片段482 bp。PCR反应条件:94℃45 s,55℃50 s,72℃75 s,在40次循环以后获取p38MAPK、ERK m RNA循环阈值(Ct),使用ΔΔCt(ΔΔCt=Ct目的基因-ΔCt内参基因)分析,算出2-ΔΔCt目的基因相对表达量。

1.5 统计学分析 采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析。计量资料以±s表示,采用方差分析进行数据比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠一般行为及体质量改变情况 正常组小鼠毛发光滑柔顺,活动及饮食正常,无异常表征；模型组小鼠出现毛发散乱、弓背直立、点头呼吸、前肢缩抬及烦躁不安等表现；阳性对照组、儿茶素低剂量组及儿茶素高剂量组小鼠症状比模型组明显改善。

模型组小鼠体质量为(50.17±3.46)g,较正常组的(72.51±3.19)g降低；阳性对照组、儿茶素低剂量组及儿茶素高剂量组小鼠体质量分别为(65.24±3.21)g、(64.82±3.37)g、(65.81±3.14)g,与模型组比较差异均有统计学意义(P值均＜0.05)。

2.2 各组小鼠BALF内分类细胞及总细胞计数情况 与正常组比较,模型组小鼠BALF内嗜酸粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞及总细胞计数均显著升高(P值均＜0.05)。与模型组比较,阳性对照组、儿茶素低剂量组及儿茶素高剂量组小鼠BALF内嗜酸粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞及总细胞计数显著降低(P值均＜0.05)。见表1。

2.3 各组小鼠BALF内IL-4、IL-5、IL-13水平情况 与正常组比较,模型组小鼠BALF内IL-4、IL-5、IL-13水平均升高(P值均＜0.05)。与模型组比较,阳性对照组、儿茶素低剂量组及儿茶素高剂量组小鼠BALF内IL-4、IL-5、IL-13水平降低,差异均有统计学意义(P值均＜0.05)。见表2。

2.4 各组小鼠支气管平滑肌病理形态情况 正常组小鼠支气管管壁完整,管腔内没有上皮细胞脱落,平滑肌厚度正常,支气管黏膜平整,无炎症细胞浸润。模型组小鼠平滑肌变厚,支气管壁内出现大量炎性细胞浸润,主要为淋巴细胞与嗜酸粒细胞,管腔内分泌物变多,支气管黏膜上皮发生脱落。阳性对照组、儿茶素低剂量组及儿茶素高剂量组小鼠平滑肌厚度接近正常组,管腔中有少许脱落细胞与黏液,支气管黏膜平整,有少量炎症细胞浸润。见图1。

表1 各组小鼠支气管肺泡灌洗液内分类细胞及总细胞计数情况(±s)

表1 各组小鼠支气管肺泡灌洗液内分类细胞及总细胞计数情况(±s)

注:与正常组比较,a P＜0.05；与模型组比较,b P＜0.05

组别 鼠数 嗜酸粒细胞(×106/ml)中性粒细胞(×106/ml)淋巴细胞(×106/ml)巨噬细胞(×106/ml)总细胞(×106/ml)正常组 10 0.07±0.02 3.14±1.08 4.09±1.39 10.69±2.37 19.48±3.67模型组 10 3.47±0.05a 12.69±1.64a 15.82±1.73a 24.99±2.16a 59.73±3.45a阳性对照组 10 1.14±0.04b 4.72±1.40b 8.26±1.60b 13.53±2.41b 28.47±3.16b儿茶素低剂量组 10 1.73±0.04b 5.96±1.58b 8.78±1.59b 13.94±2.46b 31.57±3.08b儿茶素高剂量组 10 1.52±0.05b 5.61±1.37b 8.21±1.42b 13.40±2.35b 30.68±3.25b F值 4.725 6.870 5.632 4.761 9.634 P值 0.016 0.002 0.009 0.017 0.001

表2 各组小鼠支气管肺泡灌洗液内IL-4、IL-5、IL-13水平比较(±s)

表2 各组小鼠支气管肺泡灌洗液内IL-4、IL-5、IL-13水平比较(±s)

注:与正常组比较,a P＜0.05；与模型组比较,b P＜0.05

组别 鼠数IL-13(ng/L)IL-5(ng/L)IL-4(ng/L)正常组 10 4.35±1.19 45.18±9.36 7.29±1.37模型组 10 17.64±1.82a 267.41±9.28a 21.08±1.94a阳性对照组 10 6.97±1.51b 89.71±9.13b 10.31±1.25b儿茶素低剂量组 10 7.36±1.50b 101.07±9.52b 11.76±1.42b儿茶素高剂量组 10 7.19±1.35b 98.75±9.40b 11.38±1.65b F值 7.821 16.824 10.034 P值 0.001 0.001 0.002

2.5 各组小鼠肺组织内p-p38MAPK、ERK、p-ERK及p38MAPK蛋白表达情况 与正常组比较,模型组小鼠肺组织内p-p38MAPK、p-ERK蛋白表达均升高(P值均＜0.05)。与模型组比较,阳性对照组、儿茶素低剂量组及儿茶素高剂量组小鼠肺组织内p-p38MAPK、p-ERK蛋白表达均降低,差异均有统计学意义(P值均＜0.05)。见图2、表3。

2.6 各组小鼠肺组织内p38MAPK、ERK mRNA表达情况 与正常组比较,模型组小鼠肺组织内p38MAPK、ERK m RNA表达均上升(P值均＜0.05)。与模型组比较,阳性对照组、儿茶素低剂量组及儿茶素高剂量组小鼠肺组织内p38MAPK、ERK mRNA表达均降低(P值均＜0.05)。见表4。

图2 小鼠肺组织内ERK、p-ERK、p38MAPK及p-p38MAPK蛋白表达电泳图

表3 各组小鼠肺组织内p-p38MAPK、ERK、p-ERK及p38MAPK蛋白表达(±s)

表3 各组小鼠肺组织内p-p38MAPK、ERK、p-ERK及p38MAPK蛋白表达(±s)

注:MAPK为丝裂原活化蛋白激酶；ERK为细胞外信号调节激酶；与正常组比较,a P＜0.05；与模型组比较,b P＜0.05

组别 鼠数 p-p38MAPK ERK p38MAPK p-ERK正常组 10 0.42±0.05 0.98±0.09 1.49±0.17 0.15±0.03模型组 10 1.24±0.09a 1.03±0.12 1.44±0.15 0.31±0.05a阳性对照组 10 0.76±0.08b 0.87±0.10 1.48±0.16 0.16±0.04b儿茶素低剂量组 10 0.86±0.07b 0.86±0.11 1.52±0.17 0.19±0.05b儿茶素高剂量组 10 0.83±0.06b 0.87±0.10 1.51±0.16 0.17±0.05b F值 4.823 0.637 0.488 5.012 P值 0.014 0.416 0.213 0.010

表4 各组小鼠肺组织内p38MAPK、ERK m RNA表达对比(±s)

表4 各组小鼠肺组织内p38MAPK、ERK m RNA表达对比(±s)

注:MAPK为丝裂原活化蛋白激酶；ERK为细胞外信号调节激酶；与正常组比较,a P＜0.05；与模型组比较,b P＜0.05

组别 鼠数 p38MAPK ERK正常组 10 0.08±0.03 0.03±0.01模型组 10 0.71±0.06a 0.42±0.03a阳性对照组 10 0.19±0.05b 0.17±0.02b儿茶素低剂量组 10 0.25±0.06b 0.24±0.03b儿茶素高剂量组 10 0.19±0.05b 0.16±0.03b F值 5.339 5.821 P值 0.006 0.003

3 讨论

我国的中医资源比较丰富,种类繁多。几千年的中医临床验证绝大多数的中药不良反应较小,且安全性高。我国已有数千年的茶饮文化,当前茶叶为人们日常生活主要的保健品之一。儿茶素为黄烷醇类化合物,最早从茶叶内所提取,含黄酮类成分最大。相关研究显示,儿茶素有抗炎与抗氧化等多种的药理活性[6],有研究显示,儿茶素对关节炎大鼠模型机体内炎症反应有显著抑制作用,降低肿瘤坏死因子α、IL-17及IL-1等炎性细胞含量,调节T淋巴细胞亚群内Th17/Treg平衡[7]。

过敏性哮喘为多种炎症介质、细胞因子与炎症细胞所参加气道慢性炎症性疾病,在哮喘患儿发病中气道炎症有重要影响,当前国内外诊治哮喘方案都强调控制气道炎症。多种炎性细胞参与了气道炎症,包含嗜酸粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞及巨噬细胞等。相关动物实验显示,BALF内有大量嗜酸粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞及巨噬细胞存在,这些细胞活化为哮喘典型的特点[8]。哮喘诱导机体内免疫反应,导致嗜酸粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞与巨噬细胞活化,同时向炎症部位聚集、趋化,进而分解大量组胺、内皮素、白三烯及血小板活化因子等炎性介质,对气道上皮细胞造成了间接或者直接损害,引发气道炎症。所以,嗜酸粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞与巨噬细胞也是哮喘主要的炎症效应细胞,为临床诊断哮喘主要指标。本文研究显示,模型组小鼠平滑肌变厚,支气管壁内出现大量炎性细胞浸润,主要为淋巴细胞与嗜酸粒细胞,管腔内分泌物变多,支气管黏膜上皮发生脱落,说明造模成功。另外,与模型组比较,儿茶素低剂量组及儿茶素高剂量组小鼠BALF内嗜酸粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞及总细胞计数显著降低,差异有统计学意义。同时小鼠肺组织平滑肌病理形态结果显示,儿茶素低剂量组及儿茶素高剂量组小鼠平滑肌厚度接近正常组,管腔中有少许脱落细胞与黏液,支气管黏膜平整,有少量炎症细胞浸润,说明儿茶素可使小鼠哮喘症状有效改善,抑制小鼠气道炎症反应。

MAPK为连接决定基因表达和细胞膜表层受体主要信号调节酶,MAPK信号转导路径为把细胞外信号导入细胞内的主要信号路径。在机体炎症反应内MAPK信号路径有重要影响,主要包含p38MAPK、c-Jun氨基末端激酶及ERK所介导三条级联反应,激活上述路径可加速形成炎症细胞因子而使炎症反应程度加重[9-12]。有研究显示,上游特异性刺激分子双磷酸化将ERK激活,而p-ERK活化后产生二聚体,由细胞质转移至细胞核内,经过对一系列转录因子调控,导致炎症反应[13]；p38MAPK为信号由细胞表层导入细胞核主要传递者,经过磷酸化转录因子对参加的细胞反应基因转录表达调节。p38MAPK介导形成炎症因子与基因表达,对炎性细胞凋亡、分化与增殖调控,参与了慢性气道疾病炎症机制[14-15]。所以,在p38MAPK与ERK出现磷酸化后可将ERK/MAPK信号传导路径激活。同时有研究显示,哮喘模型内ERK/MAPK信号路径中相关蛋白活性变强[16]。本文研究显示,与模型组比较,儿茶素低剂量组及儿茶素高剂量组小鼠肺组织内p-p38MAPK、p-ERK蛋白表达降低；与模型组比较,儿茶素低剂量组及儿茶素高剂量组小鼠肺组织内p38MAPK、ERK m RNA表达降低,差异有统计学意义,说明儿茶素可有效抑制小鼠机体内ERK/MAPK信号路径激活。

综上所述,儿茶素可使过敏性哮喘小鼠气道内炎症反应有效改善,其作用机制可能和抑制ERK/MAPK信号路径激活有联系。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突