广东地区高毒力肺炎克雷伯菌的微生物学特征

马明葱，李晓雨，万乔，陈志旭，卓超

(广州医科大学附属第一医院, 广东 广州 510000)

肺炎克雷伯菌，属于革兰阴性杆菌，可引起肺部感染、泌尿道感染和血液感染等[1]。近年来社区来源的高毒力肺炎克雷伯菌(hypervirulentKlebsiellapneumoniae，hvkp)受到广泛关注，是微生物感染的研究热点。高毒力肺炎克雷伯菌是台湾的科学家1986年发现的[2]，随后在台湾，韩国及其他亚洲国家均有报道[2,3,4]，而且在亚洲以外国家的报道也有所增加[5,6,7]。在其它地区报道的hvkp感染患者也主要是亚裔居民。hvkp不仅是导致肝脓肿的重要病原菌，还可引起脑膜炎、坏死性筋膜炎和眼内炎等转移性感染[8,9]，其进展快、预后差，给患者的生命带来极大威胁。hvkp菌株在琼脂平板上的菌落表现为高黏液性(hypermucoviscous)，即拉丝实验阳性，则判断为高黏液表型菌株[5]，故既往将高毒力肺炎克雷伯菌又称为高黏液表型肺炎克雷伯菌(hypermucoviscous klebsiella pneumoniae，hmkp)。但对于高黏液表型肺炎克雷伯菌是否等同于高毒力肺炎克雷伯菌，近年报道也存在争议，有研究通过小鼠实验表明，仅少数(1/5)的高黏液表型菌株表现为高毒力[10]。

铁载体气杆菌素(iucA)占hvkp总的铁载体产量的90.0%以上，和敲除气杆菌素的菌株相比，含有气杆菌素的菌株可使小鼠模型的毒力增加100倍[11]。有关hvkp菌株的定义尚无统一标准。Thomas A. Russo等表明拉丝实验定义hvkp的准确性能达到90.0%，iucA定义hvkp的准确性可达96.0%[12]。因此，在本文中我们将拉丝实验和iucA基因阳性的肺炎克雷伯菌定义hvkp。与hvkp相对应的是典型肺炎克雷伯菌(classic klebisella pneumonia，ckp)，ckp主要见于医院感染，常因对头孢菌素、碳青霉烯类的耐药使其成为多重耐药菌。普遍认为ckp的毒力较低，但2016 年中国浙江的一家医院发现了携带blaKPC-2克隆株ST11，可获得高毒力质粒，成为高耐药和高毒力菌株，并造成患者致命的结局[13-14]。因此，基于这种细菌的进化现象，以耐药性来区分hvkp和ckp只是相对而言的，须根据每个菌株的多种生物学特征予以判断。本研究的主要目的是比较性研究中国广东地区的hvkp和ckp的临床特征、细菌耐药性、分子流行病学特点及相关毒力情况。

1 材料与方法

1.1 收集菌株及患者临床资料

对2016年11月到2018年4月从广东省4家医院收集的194株培养阳性的肺炎克雷伯菌进行回顾性研究。排除同一患者的重复分离株。所有细菌均经Vitek 2 compact全自动化微生物分析系统进行细菌鉴定，储存于-80℃。并经16S rRNA基因测序再次鉴定。质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922。

1.2 拉丝实验

用接种环蘸取新鲜的肺炎克雷伯菌菌落，将接种环向上提起，若菌落形成的黏丝长度大于5 mm，则判定为拉丝实验阳性，反之则阴性。拉丝试验阳性的菌株为高黏液表型菌株[5]。

1.3 药物敏感性试验

采用肉汤稀释法测定肺炎克雷伯菌对6种抗菌药物的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)，结果判断参照2017年美国临床和实验室标准化委员会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)推荐的折点[15]。6种抗菌药物为亚胺培南，头孢呋辛，头孢曲松，头孢吡肟，环丙沙星和亚胺培南，均购自广州鼎国生物技术有限公司。质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922。

1.4 菌株MLST分型

采用煮沸法提取菌株DNA的模板。PCR体系：PCR上下游引物各1.0 μL，Premix12.5 μL，超纯水9.5 μL，DNA模板1.0ul，总共25.0 μL。PCR反应条件详见https://pubmlst.org网站。PCR阳性产物送北京六合华大基因科技股份有限公司测序，并登录(https://pubmlst.org/bigsdb?db=pubmlst_mlst_seqdef&page=sequenceQuery)网站获得7个管家基因数目，和数据库中的7个管家基因比对后获得ST型。

1.5 血清型与毒力基因

毒力基因及血清型的PCR模板提取及反应体系同前，PCR特异性引物参照文献合成[12,16,17]。所得阳性产物送北京六合华大基因科技股份有限公司进行测序，并上传BLAST数据库比对分析。

1.6 蜡螟实验

参照文献中蜡螟实验标准方法[18]，并做简要修改。

1.6.1方法 收集孵育于LB琼脂平板上18-20 h分纯的临床肺炎克雷伯菌，将单菌落加PBS(PH=6.5)调麦氏比浊度为0.5，按照预先涂板计算的0.5麦氏的菌落量(cfu/ml)。依照10的倍数进行稀释，得到104-107cfu/ml的细菌悬液。实验组注射肺炎克雷伯菌菌液，对照组仅注射PBS。注射蜡螟的菌液需再次涂板计数验证细菌量。

1.6.2蜡螟体内注射 选取300-400 mg健康状态良好(体白、运动活跃、翻身能力强等)的成熟幼虫(人工饲料喂养(奶粉，蜂蜜，蜜蜡，小麦粉，玉米面)，相对湿度为60%-70%，并常规进行消毒)，用注射器吸取20.0 ul细菌悬液，在蜡螟伪足的第一腹节进针，将细菌悬液注入蜡螟体内。所有的194株菌均进行蜡螟实验，每株细菌分4个不同浓度(104-107cfu/ml)，每个浓度的细菌菌液需注射30只蜡螟(即每组10只，重复3次)，则一株细菌需120只蜡螟。将感染的蜡螟放置培养皿中，每个培养皿只放10只感染的蜡螟，37 ℃避光培养。

1.6.3记录结果 间隔12 h(12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h)记录蜡螟死亡数量，并用回归分析方法中的probit概率法计算LD50(log10cfu/ml)，各组进行比较时采用t检验或单因素分析。

1.7 数据处理与统计学分析

采用SPSS 19.0统计软件进行分析，对计量资料采用t检验，多组计量资料的比较采用单因素分析，计数资料比较用卡方检验，P<0.05认为有统计学意义。

2 结果

2.1 菌株的来源及hvkp菌株的阳性率

2016年11月到2018年4月，从广东省4家医院共收集了194株培养阳性的肺炎克雷伯菌，血标本来源的肺炎克雷伯菌为70.1%(136/194)(图1)。本研究中hvkp的比例为33.0%(64/194)。

图1 194株肺炎克雷伯菌的标本来源

2.2 药物敏感性实验

和ckp菌株相比，hvkp对本研究中的大多数抗菌药物更敏感(P<0.05)。hvkp菌株对亚胺培南、阿米卡星、头孢呋辛、头孢曲松、头孢吡肟和环丙沙星的耐药率显著低于ckp菌株。(见表2)

表2 hvkp/ckp，血清型K1/K2的毒力基因百分比

表1 hvkp和ckp对不同抗菌药物的耐药情况比较

2.3 菌株MLST分型

对所有菌株(194株)进行MLST分析，共有75个ST型，未分型9株(均在ckp组)。hvkp中主要的ST型为ST23(17/64,26.6%)、ST65(12/64,18.8%)、ST86(8/64,12.5%)，这3种ST型占总的hvkp的比例为57.8%(37/64)。ckp中主要的ST型为ST11(18/130,13.9%)、ST15(6/130，4.6%)，ST37(5/130,3.8%)，这3种ST型占总的ckp的比例为22.3%(29/130)。

2.4 血清型与毒力基因

2.4.1血清型 hvkp中92.2%(59/64)的菌株可进行血清分型，ckp中仅17.7%(23/130)的菌株可进行血清分型。64株hvkp的血清型分型中，K2型最多，占40.6%，其他血清型依次是K1型28.1%，K57型占15.6%，K20型占4.7%，K5型占3.2%，未发现血清型K54(见图2)。130株ckp的血清型分型中，K1型为6.2%，依次是K2型5.4%，K54型占3.1%，K20型占1.5%，未发现血清型K5。血清型K1、K2、K57在hvkp中的检出率显著高于ckp(P<0.05)。

图2 hvkp和ckp中不同血清型的百分比

2.4.2毒力基因 hvkp菌株中毒力基因rmpA、rmpA2、iucA、iroB、peg-344、Alls、entB、ycfM、Irp-2、ybts、fimH、kfuB、wabG、uge、magA等的阳性检出率高于ckp菌株的检出率，其余毒力基因的阳性率在两组间无明显区别(详见表3)。血清型K1菌株中毒力基因kfuB、magA的阳性检出率高于血清型K2，而K1的毒力基因kpn的阳性检出率低于K2。其余毒力基因的检出率在血清型K1和K2间无统计学差异(详见表3)。

2.5 蜡螟实验

蜡螟实验结果表明，总的来说hvkp的LD50低于ckp(5.4±0.7(log10cfu/ml)vs5.6±0.7(log10cfu/ml)，P=0.035)，高黏液表型肺炎克雷伯菌的平均LD50低于非高黏液表型肺炎克雷伯菌(5.4±0.7(log10cfu/ml)vs5.6±0.7(log10cfu/ml)，P=0.026)。

比较hvkp和ckp间差异显著的毒力基因(P=0.000)，以及血清型K1和K2间有区别的的毒力基因菌株，hvkp中毒力基因kpn阳性的菌株的LD50大于相应的ckp菌株，差异有统计学差异(P=0.016)。其余表型的肺炎克雷伯菌感染蜡螟的LD50详见表3。

表3 hvkp和ckp中肺炎克雷伯菌感染蜡螟的LD50(log10cfu/ml)的比较

3 讨论

对2016年11月到2018年4月从广东省4家医院收集的不同感染部位的194株肺炎克雷伯菌进行回顾性研究。本文中hvkp的比例为33.0%，低于我国北京对于老年人的一项6年的研究中的hvkp的比例(45.7%)[19]，但高于国外西班牙(6.0%)，加拿大(8.2%)等地区[5]。

除少数地区发现高毒力的肺炎克雷伯菌耐药外[13]，大多数研究表明肺炎克雷伯菌高毒力株对常用抗菌药物高度敏感[20]，本研究结果与上述文献报道基本一致。本组资料显示64株hvKp菌株中发现5株耐药菌株，其中一株ST65-K2表型的hvkp为多重耐药菌株(MDR)，对亚胺培南敏感。该菌株分离自胸腔感染患者的胸腔引流液，其毒力较强，感染蜡螟的LD50为4.5，与高毒力参考菌株K1 血清型NTUH-K2044的LD50(4.1±0.3)相近[18]。该菌株的毒力和耐药机制相互关系有待下一步研究。

先前研究表明，血清型K1在hvkp中是最常见的[14,20]，但在本研究分离的64株hvkp中，血清型K2最多，高达40.6%；K1次之(28.1%)。文献报道ST23型与血清型K1和肝脓肿密切相关[5]，我们的研究结果与此相一致，但本研究中仅8例肝脓肿，可能与血清型K1少有关系。本研究还发现，ST700和ST2059也与血清型K1相关，此两类菌株均来源于血液标本，但因临床资料欠全，是否因肝脓肿播散性感染未能考证。来自新加坡，香港，台湾的研究表明，血清型K2的ST型较多样(8种ST型)[21]。本文中血清型K2的ST型也较多样，以ST65最常见。先前的研究表明ST268仅与血清型K20相关[22]，本文中的ST268和ST893均为血清型K20。与既往研究一致，血清型K1、K2、K57与hvkp相关[22-23]。

既往研究显示，rmpA/rmpA2，调节胞外脂多糖的合成，与高黏液表型密切相关，也认为是hvkp 重要生物标记物[24,25]，但在本研究中仅66.7%的hvkp为rmpA阳性，提示可能存在其他机制调节高黏液表型的表达[25]。此外，Guo等收集多种感染部位的肺炎克雷伯菌，结果表明与non-hvkp相比，hvkp中rmpA多，但rmpA在血清型K1和K2间无区别，与本文中hvkp的研究结果一致[22]。铁载体肠杆菌素(entB)、气杆菌素(iucA)、沙门菌素(iroB)、耶尔森菌素(ybts,irp-2)、kfu等均介导三价铁的摄取，均是肺炎克雷伯菌感染的重要的毒力因子[26,27,28]。本文中iucA、iroB、ybts、irp-2、kfu等在hvkp中的阳性率高于ckp，和既往的研究一致。既往研究表明血液和肝脓肿中的肺炎克雷伯菌的血清型K1均有kfuB基因，但血清型K2均无[29]。Lin等收集香港、新加坡和台湾的肝脓肿和非感染性携带者的血清型K2，结果表明血清型K2中kfuB基因的比例为11.5%[30]。本研究表明，K1中kfuB基因的比例为66.6%，K2中kfuB基因的比例为26.1%，表明kfu与血清型K1无特异性的关系。本研究中大多数的菌株携带fimH基因，但在hvkp菌株中的阳性率高于ckp，差异有统计学意义，与既往研究一致[22]。另外一个与菌毛相关的基因kpn，其阳性率在hvkp和ckp间无明显差异，但在血清型K2中的阳性率高于K1。

和既往小鼠模型研究结果一致[31]，本研究蜡螟实验显示，高黏液表型的肺炎克雷伯菌的毒力强于非高黏液表型的肺炎克雷伯菌，hvkp的毒力强于ckp。毒力基因的比较发现，除毒力基因kpn外，未发现其余表型在hvkp和ckp间的差异，表明不能仅单一依靠一种表型定义hvkp。毒力基因kpn阳性的菌株中hvkp的毒力大于ckp，表明该基因可能成为鉴定高毒力的生物标志。另血清型K2中有3株ST25，2株毒力基因kpn阳性，蜡螟实验表明其毒力较强，LD50与K1参考株(NTUH-K2044)的LD50(4.1±0.3)一致[18]；它们是收集自不同时间同一科室的细菌，1株来自血液，2株来自引流物，治疗期间给与了美罗培南，阿米卡星，环丙沙星的联合治疗。该3例患者的临床结局均为死亡。虽然高毒力的ST25-K2肺炎克雷伯菌目前未形成流行克隆，但基于其高危害性，在临床监测中应警惕[32,33]。