MEBT/MEBO对慢性创面组织STAT6和SOCS1表达的影响

岑小宁，唐乾利，黄许森，兰海生，卓臣义，冯时，唐习强，韦骋，包崇婵

(1.右江民族医学院 桂西高发病防治重点实验室，广西 百色 533000；2.右江民族医学院附属医院，广西 百色 533000)

慢性难愈合创面俗称溃疡，我国患病率约为1.7%，给社会及患者家庭带来了沉重的负担[1-2]。创面愈合结局包括再生和瘢痕修复，瘢痕修复影响美观，且关节处会限制其活动，因此探寻一种抑制瘢痕形成并促进再生的方法成为研究热点。皮肤再生医疗技术湿润暴露疗法/湿润烧伤膏(moist exposed burn therapy/moist exposed burn ointment，MEBT/MEBO)经过近30年基础研究和临床实践，已广泛用于各种慢性难愈合创面的临床治疗，但其抑制瘢痕形成和促进组织再生的机制并未完全明了。研究发现多种因子参与创面修复过程，其中信号转导和转录激活因子6(signal transduction and activator of transcription 6，STAT6)在创面愈合过程中起促进瘢痕修复的作用，而细胞因子信号转导抑制蛋白1(suppressor of cytokine signaling 1，SOCS1)为STAT6的抑制因子，在创面修复中起抑制瘢痕形成和促进组织再生的作用[3-5]。本研究构建慢性难愈合创面大鼠模型，探讨MEBT/MEBO对慢性难愈合创面组织STAT6和SOCS1表达的影响，报道如下。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

湿润烧伤膏(商品名：美宝，汕头美宝制药)，重组牛碱性成纤维细胞生长因子外用凝胶(商品名：贝复新，珠海亿胜)，氯胺酮(江苏恒瑞医药)，甲苯噻嗪(上海安谱)。SOCS1抗体(美国Affinity)，STAT6抗体(武汉博士德)，β-actin抗体、山羊抗兔二抗(北京中杉金桥)。HiFiScriptT快速去除基因组cDNA第一条链合成试剂盒、UltraSYBR Mixture荧光定量PCR试剂盒(北京康为世纪)。HF-300型电子天平(日本AND)，组织切片机(德国Leitz)，X5Z-H型生物显微镜(重庆光学仪器厂)，BX61型显微镜(日本Olympus)，4℃低温离心机(德国Eppendorf)。免疫印迹检测全套系统(美国BIO-RAD)，超微量紫外分光光度计(美国Beckmancoulter)，酶标仪(美国赛默飞)，实时荧光定量PCR仪(美国Roche)。

1.2 实验动物

12周龄健康成年SPF级Wistar雄性大鼠54只，体质量220～250 g，购于长沙天勤生物技术有限公司，许可证号：SCXK(湘)2014-0011。本研究符合实验动物伦理学有关要求。

1.3 大鼠慢性难愈合创面模型的建立

参照赵京禹等[6]全层皮肤缺损法和沈氏改良塑料环肉芽肿定量法[7]，经改进后制做慢性难愈合创面大鼠模型。使用甲苯噻嗪、氯胺酮腹腔内注射麻醉大鼠，麻醉起效后用电动刹刀剃去背部毛发，清水擦洗背部皮肤，然后置于28～30 ℃环境中，复苏后喂食24 h以上，待损伤作用消失后再开展实验。再以同样方式麻醉大鼠，以图章进行建模面积标记，沿脊柱方向于背部做一个开放性创面，创面直径为15 mm，深度至筋膜，然后覆盖消毒干纱布，以胶布固定。建模后注射醋酸氢化可的松8 mg/100 g，建立大鼠慢性难愈合创面模型。

1.4 动物分组及处理

大鼠适应性喂养1周后，随机分为模型组、美宝组和贝复新组，每组18只，均按上述方法建立大鼠慢性难愈合创面模型。建模后用呋喃西林液清洁创面，各组大鼠使用不同纱布覆盖创面。(1)美宝组：创面敷两层美宝纱布，根据创面大小裁剪纱布贴于创面部位，然后以两层消毒干纱布进行创面覆盖，并以胶布进行固定；(2)贝复新组：创面覆盖两层浸润贝复新的纱布，纱条裁剪及覆盖、固定方式同美宝组；(3)模型组：创面外敷两层生理盐水纱布，纱条裁剪及覆盖、固定方式同美宝组。

分别于建模后第3、7、14天随机断颈处死大鼠，每组6只。取深筋膜下层创面及周围组织置于滤纸上，然后从正中间将组织标本切开，一半以滤纸包裹置于包埋盒，10%中性福尔马林液中存放24 h，然后取出置于70%乙醇中，存放环境为4 ℃，应用Masson染色进行组织病理观察；另一半置于冻存管中液氮冻存，然后将样品置于-80℃冰箱内保存，用于免疫印迹和实时定量PCR(RT-qPCR)检测。

1.5 观察指标

1.5.1创面愈合时间及创面愈合率 收集创面组织样本观察各组大鼠创面愈合，同时比较建模后第3、7、14天各组大鼠创面愈合率。于上述各时点分别在固定焦距下进行创面拍照，使用Image J软件测量创面面积，计算创面愈合率。创面愈合率=(初始创面面积-观察日创面面积)/初始创面面积×100%。

1.5.2创面组织病理观察 建模后第3、7、14天，应用Masson染色观察创面组织病理改变。

1.5.3STAT6、SOCS1 mRNA表达检测 建模后第3、7、14天收集创面组织样本，使用RT-qPCR检测STAT6、SOCS1 mRNA的表达。用Trizol提取组织总RNA，行1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。按反转录试剂盒说明书进行反转录，以β-actin为内参照进行RT-qPCR检测。引物序列如下：SOCS1上游引物5’ CCGCTCCCACTCTGATTACCG 3’，下游引物5’ CGAAGCCATCTTCACGCTGA 3’；STAT6上游引物5’ GAAAGGACGGGAGGGGTTA 3’，下游引物5’ CTGAAATGAGTGGATGGAATG 3’；β-actin上游引物5’ CCTAGACTTCGAGCAAGAGA 3’，下游引物5’ GGAAGGAAGGCTGGAAG 3’。 采用2-△△Ct法计算目的基因的表达量。

1.5.4STAT6、SOCS1蛋白表达检测 建模后第3、7、14天收集创面组织样本，分别称重后剪碎置于冰面，予匀浆机捣碎分装于离心管中，加入RIPA裂解液充分混匀，4℃冰箱过夜。4℃条件下12 000 r/min(离心半径10 cm)离心10 min，取上清测定蛋白浓度。以β-actin为内参照，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测STAT6、SOCS1蛋白表达。按说明书制备SDS-PAGE凝胶，样品变性后电泳，凝胶转膜后进行检测。胶片扫描后用Tanon Gis软件测定各条带吸光度值，以目的条带与β-actin条带的吸光度值比值表示目的蛋白的相对表达量。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 创面愈合时间比较

美宝组与贝复新组创面愈合时间较模型组均明显缩短(均P<0.05)，但两组组间比较差异无统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠创面愈合时间

2.2 创面愈合率比较

建模后第3天，3组创面愈合率比较差异无统计学意义(P>0.05)。建模后第7、14天，贝复新组与美宝组创面愈合率均高于模型组(均P<0.05)，但贝复新组与美宝组创面愈合率差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表2。

表2 不同时点各组大鼠创面愈合率

2.3 各组大鼠创面组织病理观察

大鼠创面组织行Masson染色进行病理观察。建模后第3天，3组大鼠创面组织形态学差异不明显，创面组织中见大量炎性细胞浸润及明显组织水肿，新生毛细血管很少。建模后第7天，美宝组和贝复新组创面组织均可见大量毛细血管生成，炎性细胞明显减少，可见不成熟的毛囊结构生成；模型组创面组织中仍有较多的炎性细胞浸润，新生毛细血管较美宝组和贝复新组少，未见毛囊结构生成。建模后第14天，美宝组和贝复新组创面组织中均可见整齐排列的毛细血管及成熟的毛囊、皮脂腺等；模型组创面可见大量成纤维细胞及少量炎性细胞。见图1。

图1 不同时点3组大鼠创面组织病理观察(Masson染色 ×100)

2.4 STAT6、SOCS1 mRNA表达检测

建模后第3、7天，美宝组与贝复新组STAT6 mRNA表达均明显低于模型组(均P<0.05)，而第14天3组STAT6 mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)。建模后第3、7、14天，美宝组和贝复新组STAT6 mRNA表达先降低后增高，而模型组呈持续降低(均P<0.05)。见表3。建模后第3、7天，美宝组与贝复新组SOCS1 mRNA表达均高于模型组(均P<0.05)，而第14天3组SOCS1 mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)。建模后第3、7、14天，美宝组和贝复新组SOCS1 mRNA表达先升高后降低，而模型组持续升高(均P<0.05)。见表4。

表3 不同时点各组大鼠创面组织STAT6 mRNA表达

表4 不同时点各组大鼠创面组织SOCS1 mRNA表达

2.5 STAT6、SOCS1蛋白表达检测

建模后第3、7、14天，美宝组与贝复新组STAT6蛋白表达均低于模型组(均P<0.05)。建模后第3、7、14天，美宝组和贝复新组STAT6蛋白表达先降低后增高，而模型组呈持续降低(均P<0.05)。建模后第3、7天，美宝组与贝复新组SOCS1蛋白表达均明显高于模型组(均P<0.05)，而第14天3组SOCS1蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。建模后第3、7、14天，美宝组和贝复新组SOCS1蛋白表达先升高后降低，而模型组呈持续升高(均P<0.05)。见图2，表5，表6。

注：1：美宝组；2：贝复新组；3：模型组

表5 不同时点各组大鼠创面组织STAT6蛋白表达

表6 不同时点各组大鼠创面组织SOCS1蛋白表达

3 讨论

慢性难愈合创面严重危害人类健康，多发生于糖尿病、创伤、神经病变、截瘫、长期卧床等患者[8]，不仅影响患者生活质量，造成经济损失，长期存在甚至有癌变风险[9-10]。目前关于慢性难愈合创面的修复机制尚不完全清楚，临床疗效仍不能令人满意，寻找安全有效的治疗措施有重要的意义。唐乾利等[11-14]将MEBT/MEBO应用于慢性创面显示疗效显著，但具体机制仍不明确，本研究观察MEBT/MEBO对慢性创面组织STAT6和SOCS1表达的影响，以探讨其作用机制。

哺乳动物因再生能力有限，其创面愈合以疤痕愈合为主。研究显示，2型固有免疫反应可促进纤维化的产生，在促进损伤组织纤维化中发挥着重要作用[15]。2型固有免疫反应以2型辅助型T细胞(Th2)相关的白细胞介素4(IL-4)、IL-13最具代表性，IL-4/IL-13信号通路的激活可促进IL-4受体(IL-4R)的表达，并进一步激活STAT6的表达[15-16]。STAT6在创面修复过程中起到促进瘢痕修复的作用，STAT6能够诱导SOCS1的表达，SOCS1通过抑制STAT6的活化来阻碍Th2的分化成熟[3-4]。因此，SOCS1介导的JAK激酶活性抑制能负调控STAT6的功能，而SOCS和JAK激酶竞争激活STAT则为STAT6的负反馈控制。Heller等[5]报道，诱导SOCS1表达可通过IFN-γ/STAT1通路沉默STAT6表达，因此SOCS1在慢性创面修复中起促进皮肤再生、抑制瘢痕修复的作用。

本研究显示，美宝组与贝复新组创面愈合率均较模型组升高，创面愈合时间均较模型组缩短，且两组病理学形态改善均优于模型组；免疫印迹及RT-qPCR显示MEBT/MEBO能够显著降低慢性难愈合创面组织STAT6 mRNA及蛋白表达，增加SOCS1 mRNA及蛋白表达。目前对IL-4/IL-13/STAT6通路的研究主要集中在哮喘、类风湿关节炎、溃疡性结肠炎、肝硬化等疾病，在创面修复领域的研究较少。有研究显示抑制STAT6通路可降低炎症反应，促毛细血管生成，缩短创面愈合时间，提高愈合率[17-19]，与本研究结果一致。

综上述，本研究成功建立慢性难愈合创面大鼠模型，发现MEBT/MEBO可通过调控创面组织中STAT6和SOCS1的表达而促进创面愈合。但由于本研究仅进行了动物实验，有待开展临床研究进一步证实。