PCK1在肾透明细胞癌中的表达及其临床意义

凌济忠，张玉婷，习明，华伟，江敏耀，万跃平，万颂*

(1.广州市花都区花山镇卫生院外科，广东 广州 510880；2.广州医科大学南山学院，广东 广州 511436；3.南方医科大学花都区人民医院泌尿外科，广东 广州 510800)

透明细胞肾细胞癌(clear cell renal cell carcinoma，ccRCC)是肾脏恶性肿瘤中常见的病理类型[1]，以糖原水平升高和脂肪堆积为特征[2]。磷酸烯醇丙酮酸羧激酶1(phosphoenolpyruvate carboxykinase，PCK1)是糖异生途径中的一个限速酶，能催化草酰乙酸形成磷酸烯醇式丙酮酸和二氧化碳，并在糖异生、丝氨酸合成和氨基酸代谢中发挥着重要的功能[3]。既往研究结果表明，PCK1在人体多种肿瘤中呈异常表达，如肝细胞癌、乳腺癌和结直肠癌[4-6]，但其在ccRCC中的表达情况目前还不明确。基于此，本研究通过观察PCK1在ccRCC中的表达情况及其与患者生存率之间的相关性，旨在探讨PCK1表达对预测ccRCC患者预后的价值。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究收集30对肾癌和癌旁肾组织标本，来源于广州市第一人民医院，所有病例术前未行化学治疗或放射治疗。

1.2 癌症基因组图谱

癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)(http://cancergenome.nih.gov)是美国国立癌症研究所创立的肿瘤全基因组测序数据库，包含人类约33种癌症，其中肾癌数据库605例，其中正常肾组织72例、ccRCC组织530例。

1.3 免疫组织化学检测

本次免疫组织化学实验利用的PCK1抗体购于中国北京博奥森公司(货号：bs-4972R)，组织取材后，马上放置于10%福尔马林中固定，随后石蜡包埋，组织经切片后，行苏木精-伊红(hematoxylin-eosin staining，HE)染色法，经我院病理医师确诊为ccRCC后，方可用作本次研究。组织切成4 μm切片，经二甲苯脱蜡后，随后按酒精梯度水化(100%，95%，90%，80%，70%)，随后经过枸橼酸抗原修复液(pH6.0)修复、3%过氧化氢溶液阻断内源性过氧化物酶和非免疫性兔血清封闭后，按1∶100比例稀释一抗(兔抗PCK1多克隆抗体)，放置于孵育盒中，4 ℃过夜，同时以兔抗IgG作为同型阴性对照。次日，将组织切片恢复至室温，PBS泡洗切片，按1∶100加入羊抗兔二抗溶液，随后加入链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液，30 min后进行二氨基联苯胺(DAB)染色。染色后，进行苏木素复染、经梯度酒精脱水干燥，中性树脂封片。免疫组化评分由两位有经验的病理科医师进行独立评分，且两位病理医师对患者的临床病理信息不知情。最终评分取两位病理医师评分的平均值。本次免疫组织化学评分(immunoreactive score，IRS)采用强度+范围评定每一例的蛋白表达水平，具体评分方法如下：每例随机选取镜下5个视野，根据抗体说明书，细胞质染色定为阳性表达，根据染色强度(0：阴性，1：弱阳性，2：中等阳性，3：强阳性)和染色的比例(0：<25%，1∶25%～50%，2：50%～75%，3：>75%)来评定每一例的蛋白表达水平，IRS评分采用染色强度加上染色比例作为这一例的最终评分。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 PCK1在ccRCC和癌旁组织中的mRNA和蛋白表达情况

PCK1在癌旁组织和ccRCC中的表达水平分别为5.45±1.34和3.34±0.84，两者比较，差异均有统计学意义(P=0.001)(见图1，表1)。结合TCGA数据库，PCK1的mRNA表达量在癌旁组织中明显上调，而在ccRCC组织中明显下调(3.75±0.87vs3.37±0.16,P<0.001)，见表1。

图1 PCK1在正常肾组织和ccRCC中的蛋白表达(*P<0.05)

2.2 PCK1表达与ccRCC临床病理特征的关系

TCGA数据库分析结果显示，男性、低病理分期、非转移的和生存率高的患者中PCK1 mRNA表达水平高于女性、高病理分期、出现转移和低生存率的患者(P均<0.05)；但PCK1蛋白表达水平在低病理分期和高病理分期中的差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 PCK1表达与ccRCC临床信息的相关性

2.3 PCK1表达与ccRCC患者生存率的相关性

根据TCGA数据库，以PCK1 mRNA表达量中位数为分割点，将PCK1分为高表达组和低表达组，利用Kaplan-Meier生存曲线分析PCK1与ccRCC患者总体生存率的相关性，结果显示，高表达组总体生存率明显高于低表达组(P<0.05)，见图2。

图2 TCGA数据库中PCK1表达与ccRCC患者的生存曲线分析

2.4 PCK1表达在TCGA数据库中的COX回归统计

COX风险回归生存模型分析结果显示，PCK1高表达与ccRCC患者良好预后密切相关(P<0.05)，见表2。

表2 PCK1在ccRCC病人中的总体生存COX风险回归与临床病理特征的关系

3 讨论

ccRCC是人类肾脏恶性肿瘤中常见的病理类型。ccRCC的发生与发展是多阶段、多因素进程，不同的分子机制影响其进展和预后。有研究结果显示，果糖1,6二磷酸酶1(fructose-1,6-bisphosphatase 1，FBP1)是糖异生过程中的限速酶，催化1,6二磷酸果糖水解而发挥抑制作用，与ccRCC进展呈负相关，这提示我们ccRCC与代谢密切相关[7-9]。

PCK基因有两种异构体，分别是表达于细胞质的PCK1和表达于线粒体的PCK2。目前，PCK1研究较为广泛，PCK1基因定位于人体染色体20q13.31区域，在多种肿瘤中呈异常表达。有研究结果显示，PCK1在肝细胞癌组织中呈低表达，且PCK1上第124位赖氨酸位点能被Nur77抑制其发生SUMO化修饰，从而提高PCK1基因编码蛋白的稳定性，增强糖异生，抑制糖酵解，抑制肝癌进展[9]， Li等[10]也发现，PCK1的表达是黑色素瘤患者的代谢特征之一，作可为治疗黑色素瘤的潜在靶点10。但目前PCK1在ccRCC中的表达情况尚缺乏相关报道。

本研究结果显示，ccRCC中PCK1的mRNA和蛋白表达水平均较癌旁组织升高，在低病理分期和无转移的病例中的表达水平高于高病理分期和转移病例，这说明PCK1作为抑癌因子，其表达与ccRCC恶性程度呈负相关。通过生存分析，我们还发现，PCK1表达越高，ccRCC患者生存率越高，预后越好；COX风险回归生存模型也提示，PCK1高表达患者，死亡风险较低。

综上所述，PCK1表达与ccRCC临床进展呈负相关，有望成为该病的生物标记物，本研究为ccRCC治疗提供了新的方向，但具体作用机制还有待进一步研究。