黄连素抑制机械牵张力诱导的血管平滑肌细胞MAPK磷酸化以及细胞增殖和迁移

邓 烈，王林丽，刘树迎，李朝红

（中山大学中山医学院组织学与胚胎学教研室，广东广州 510080）

血管重塑（vascular remodeling，VR）系指血管壁在局部生长因子、血管活性物质及血流动力学刺激等作用下，管壁发生结构与功能改变的主动过程［1］。高血压［2-3］、高血脂［4-5］以及高血糖［6］单独或合并作用均可引起血管重构，加速动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）病变发展。平滑肌细胞的表型改变［7］、迁移、异常增殖或凋亡是VR的重要原因之一［8-9］。其中，高血压产生的对血管壁的机械牵张力在血管的重构与疾病发生发展过程中起决定作用［10-11］。新近研究［11］显示，机械牵张力可引起血管平滑肌细胞膜上所有跨膜蛋白构型改变，致使多信号通路同步激活，引起血管平滑肌细胞增殖和凋亡同时增加，加速VR。因此，如何防止血压升高产生的机械力对细胞的异常作用是防治重点。黄连素（berberine，BBR）是一种生物碱，主要来源黄连、黄檗。有报道称黄连素可抑制肿瘤细胞增殖［12-13］、抗炎［14］、降血脂［15-16］、治疗肥胖作用［17-19］、降低胰岛素抵抗、提高葡萄糖代谢效率［20］，保护受损血管［21］，以及治疗阿尔兹海默症的作用［22］。在我国的多项临床研究中，研究者将口服降糖药格列吡嗪［23］、抗高血压药苯磺酸氨氯地平［24］、调血脂药阿托伐他汀钙［25］联合黄连素使用，发现能很好地提高降糖药、抗高血压、调血脂药的治疗效率，暗示黄连素具有很好的心血管治疗潜力。但黄连素是否可抑制机械力诱导的VSMC增殖、迁移的发生未见文献报道。本研究我们首次提出黄连素可通过抑制机械力诱导的MAPK活性增加，进而抑制VSMC增殖和迁移作用。

1 材料与方法

1.1 细胞系与主要试剂

血管平滑肌细胞源于小鼠主动脉的原代分离。培养基DMEM、青-链霉素双抗购自gibco，胎牛血清购自天津TBD，黄连素购自成都威尔曼标准品公司。Ki67抗体购自Santa Cruz、MAPK磷酸化抗体购自CST公司。本研究经本单位伦理委员会批准实施。

1.2 细胞培养

在37 ℃、体积分数5% CO2的潮湿环境中，血管平滑肌细胞（VSMC）培养于含100 ml/L胎牛血清和1%青-链霉素的DMEM培养基。VSMC每隔2 d换培养基1次，当细胞达到90%融合时按1∶2比例传代。后续实验使用第3代到第10代的VSMC。

1.3 细胞牵拉处理

将VSMC种于硅胶弹性底细胞培养板中（Flexcell，Meckeesport，PA），当细胞达到90%融合后，无血清培养基饥饿处理24 h，再进行牵拉处理。我们使用的牵拉仪主要由一个真空泵和一个培养板底座（FX3000 AFC-CTL，Flexcell）构成。真空泵会重复地形成15～20 KPa的真空状态，真空力反复地（60次/min）牵拉培养板的弹性硅胶底部及VSMC。牵拉时，将细胞培养板放置于二氧化碳培养箱内，细胞处于含体积分数5% CO2的37℃环境中。牵拉仪的牵拉强度可以设定5%～30%之间，牵拉强度是指培养板的硅胶底部受拉伸的变形程度。根据此前的研究结果，本实验将牵拉强度设定为10%。检测MAPK磷酸化实验的细胞牵拉时间为15 min，细胞增殖迁移实验的牵拉时间为1 h。在检测黄连素对牵张力作用的影响时，先用黄连素预处理1 h，再按上述进行相应的牵拉处理。

1.4 免疫荧光检测ki67表达

VSMC传代时，将约1×106个/mL VSMC接种于牵拉培养板中，培养至VSMC达到60%融合，换无血清DMEM培养基饥饿处理24 h。在检测SS对VSMC增殖作用实验中，VSMC进行牵拉处理1 h后，再培养23 h后进行免疫荧光实验。在检测黄连素对SS的增殖作用影响的实验中，先用黄连素（60 μg/mL）预处理1 h，然后进行牵拉处理1 h，继而再培养23 h，收集细胞进行免疫荧光实验。

收集的VSMC先用40 g/L多聚甲醛固定10 min，再用含0.5%Triton-x的PBS破膜10 min，经过含10 g/L胎牛血清白蛋白（BSA）的PBS封闭30 min后进行相应的染色处理。增殖的VSMC用ki67标记，总VSMC用4′，6-diamidino-2-phenylindole（DAPI）（0.001%）标记，我们使用莱卡DM4000B研究级倒置荧光显微镜进行观察并拍照，记录每个视野下ki67阳性的细胞数和总细胞数，以ki67细胞阳性率进行统计分析。使用的抗体如下：TRITC荧光标记二抗（1∶500）、ki67抗体（1∶100，Santa Cruz）。

1.5 划痕实验检测细胞迁移能力

VSMC传代时，将约1×106个/mL VSMC接种于特制的牵拉培养板中，培养至VSMC达到60%融合，换无血清DMEM培养基饥饿处理，然后用100 μL的tips对培养板底部的单层VSMC划痕，长度约2 cm。划痕后用无菌的PBS洗涤两次，以除去划痕时受伤的细胞。实验分组为：NC组、SS组、BBR+SS组、BBR组。NC组的VSMC再培养24 h进行划痕宽度的测量；SS组的VSMC进行牵拉处理1 h后，再培养23 h后进行划痕宽度的测量；BBR+SS组的VSMC先用黄连素预处理1 h，再进行牵拉处理1 h，再培养23 h进行划痕宽度的测量；BBR组的VSMC用黄连素处理1 h后再换无血清的DMEM继续培养23 h，然后进行划痕宽度的测量。实验结束时，我们用研究级倒置相差显微镜观察并拍照，记录每组的划痕边界距离，计算每组的细胞群边界距离作为细胞的迁移距离，进行统计分析。

1.6 蛋白质印迹检测MAPK磷酸化

分组处理VSMC后，收集细胞，PBS清洗3次，加入含蛋白酶抑制剂和磷酸化酶抑制剂的细胞裂解液进行裂解提取总蛋白质，等量蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳分离，转膜至PVDF膜，然后用5%的脱脂奶粉/TBS液进行封闭，再依次孵育P-ERK、P-JNK、P-P38、ERK、JNK和P38抗体和辣根过氧化物酶标记二抗（HRP），最后进行显影成像并统计灰度值计算。P-ERK、P-JNK、P-P38、ERK、JNK和P38抗体用含5%BSA的TBS缓冲液配制，浓度都是1∶1 000。

1.7 统计学方法

实验数据的统计分析使用SPSS 20进行，计量资料用或M（P25～P75）表示，多组均数比较，若数据满足独立、正态、方差齐性，采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。若不满足方差分析的条件则采用非参数Kruskal-WallisH检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 黄连素抑制SS诱导的MAPK磷酸化

为探索黄连素对机械力诱导MAPK磷酸化作用影响的分子机制，蛋白印迹分析MAPK信号通路相关蛋白的磷酸化，本实验进行了3次生物学重复。在本实验中，我们观察了一系列浓度梯度（0、2、20、40和60 μg/mL）的黄连素对牵张力诱导的MAPK磷酸化的影响作用。实验结果显示，给予VSMC牵张力刺激15 min，ERK、JNK和P38通路磷酸化都明显增加，并且黄连素预处理后MAPK磷酸化受到了明显的抑制，并且呈现浓度依赖（表1，图1）。

表中BBR-2组表示VSMC先用2 μg/mL预处理1 h；BBR-20组表示VSMC先用20 μg/mL预处理1 h；BBR-40组表示VSMC先用40 μg/mL预处理1 h；BBR-60组表示VSMC先用60 μg/mL预处理1 h，再进行牵拉刺激15 min。

2.2 黄连素可抑制SS诱导的VSMC增殖

利用免疫荧光检测增殖生物标志物ki67的表达水平变化来观察黄连素（60 μg/mL）对SS诱导的VSMC增殖作用影响，本实验进行了3次生物学重复。图2中ki67阳性细胞与细胞总数及细胞ki67阳性率见表2。以细胞ki67阳性率作统计分析，SS组与NC组比较，ki67阳性VSMC明显增加（P=0.002 ＜0.05），SS组的ki67阳性细胞是NC组的7倍，说明牵张力能明显促进VSMC的增殖；BBR+SS组与SS组比较，ki67阳性VSMC明显减少（P=0.0185 ＜0.05），说明黄连素预处理后再给予牵张力刺激，VSMC的增殖受到了抑制，计算得到的黄连素抑制率约为70%；BBR组与NC组比较，ki67阳性VSMC增减不明显，P=0.5072 ＞0.05，无统计学差异，说明黄连素预处理不会促进VSMC增殖。

表1 MAPK磷酸化各组比较的统计结果Table 1 The statistical results of MAPK phosphorylation［n=3，M（P25～P75）］

图1 应用蛋白质印迹方法检测各组VSMC的MAPK磷酸化作用Fig.1 detecting the phosphorylation of MAPK using western blotting in such groups

表2 黄连素对SS诱导的VSMC增殖作用的统计结果Table 2 The statistical results of berberine inhibiting VSMC proliferation induced by SS［n=3，%（n），M（P25～P75）］

表3 黄连素对SS诱导的VSMC迁移作用Table 3 berberine inhibits VSMC migration induced by SS［n=3，M（P25～P75）］

2.3 黄连素可抑制SS诱导的VSMC迁移

利用划痕实验来研究黄连素（60 μg/mL）对SS诱导的VSMC迁移作用影响，本实验进行了3次生物学重复。实验结果显示，与NC组相比，SS组的VSMC再培养23 h后划痕距离明显减少，细胞的迁移距离明显增加（P=0.002 ＜0.01）；相对于SS组，BBR+SS组划痕的距离则明显的增加，细胞迁移距离减少（P=0.0226 ＜0.05，说明黄连素可明显抑制SS诱导的VMSC迁移；BBR组与NC组比较，划痕的距离无明显变化，细胞迁移距离无明显变化（P=0.25 ＞0.05）。结果显示，SS增加了VSMC的迁移能力；黄连素预处理后，VSMC的迁移能力受到了明显的抑制，而且，黄连素本身对VSMC的迁移能力无明显的作用（表3，图3）。

3 讨论

本研究观察了黄连素对机械力牵拉引起的血管平滑肌细胞MAPK磷酸化、增殖和迁移的影响。首次发现黄连素不仅能明显抑制机械牵拉力引起的血管平滑肌细胞MAPK磷酸化增加，而且还能抑制机械牵拉力引起的血管平滑肌细胞增殖和迁移增加。这些结果可为中国传统中药黄连素在临床上的更广泛应用的机制研究提供重要资料。

图2 应用免疫荧光方法检测各组VSMC的增殖情况Fig.2 The proliferation of VSMC in such groups was detected by immunofluorescence

血压升高产生异常机械力可非特异性激活细胞膜上所有跨膜蛋白，进而激活细胞内众多信号通路，包括蛋白激酶系统MAPK［4］、PKC［26-27］，氧化还原系统NADPH［28］、PDI［29］，炎症系统NF⁃κB［30］、炎症因子以及细胞因子［31］等。然而，资料显示能够同时阻断机械力多信号通路的药物报道不多。本研究中，我们第一次尝试用黄连素干预机械力作用，获得了重要结果。机械牵拉可明显激活细胞内MAPK三成分ERK，JNK和p38磷酸化增加，而黄连素可呈浓度依赖性抑制机械力牵拉引起的细胞内信号通路MAPK磷酸化增加。因此，本研究结果为黄连素降低高血压机制研究提供重要资料。

图3 应用划痕实验（愈伤实验）方法检测各组VSMC迁移情况Fig.3 The migration of VSMC in such groups was detected by wound-heal assay

血液流经血管主要产生与血管壁平行的剪切力（shear stress）以及与血管壁垂直向外扩张的牵张力（stretch stress），前者主要对血管内皮起作用，而后者对管壁三层中的所有细胞均起作用，包括内膜的内皮细胞、中膜的平滑肌细胞以及外膜的成纤维细胞等。血压升高产生的异常机械力导致内皮损伤、平滑肌细胞表型转化、迁移和异常增殖，最终引起动脉血管粥样硬化病变。因此，如何抑制平滑肌细胞异常迁移和增殖是防治高血压血管重构的重要方向。本研究中我们发现机械力可引起体外培养的血管平滑肌细胞增殖和迁移增加，而黄连素可明显抑制机械力诱导的平滑肌细胞增殖和迁移增加。该结果从病理生理学方面为黄连素防治高血压血管疾病的致病机制研究提供有用的证据。

黄连素是我国临床上常用的传统中药，除了常用于治疗腹泻、抑制消化道细菌生长外，新近报道显示黄连素可抗高血压、高血脂以及高血糖引起血管动脉粥样化的作用以及抗肿瘤细胞增殖等，但其作用机制仍不十分明了。本研究首次将其应用于阻断机械力作用，发现其不仅能够抑制机械力牵拉引起MAPK磷酸化增加，还可抑制平滑肌细胞的迁移和增殖。因此，这一研究结果提供了黄连素旧药新用途的机制，为拓展传统中药的多疾病防治应用提供了重要资料。

总之，本研究第一次观察到黄连素可对机械力牵拉引起的VSMC细胞增殖、迁移以及细胞内MAPK磷酸化增加等起到明显抑制作用；可为因VSMC结构与功能改变所致血管疾病如高血压的防治机制研究提供重要资料；同时揭示了传统中药黄连素的新用途和新机制。