长链非编码RNA HULC对胶质母细胞瘤原位移植瘤模型肿瘤生长的促进作用

胡宇辰，尹恬恬，李 倩，叶 珊，吴 景，何 杰，

（1.安徽医科大学附属省立医院//中国科学技术大学附属第一医院，安徽 合肥 230001；2.安徽医科大学第二附属医院，安徽 合肥 230601；3.中国科学技术大学附属第一医院临床病理中心，安徽 合肥 230001）

胶质母细胞瘤（glioblastoma，GBM）是最常见的颅内原发性恶性肿瘤，约占所有脑肿瘤的80%［1］，WHO分级为Ⅳ级［2］。目前手术、放疗和化疗等常规治疗手段疗效不佳，大多数患者预后差、生存期短，中位生存期仅12～14个月［3］，侵袭性生长是恶性的主要特征。ENCODE项目联合会目前估算了有超过28 000种不同的LncRNA［4］，广泛参与各种恶性肿瘤的生物进程，包括肿瘤细胞增殖、侵袭、迁移、凋亡及EMT等功能的调节，在肿瘤的发生发展中发挥着重要作用［5］。通过研究GBM与LncRNA之间的关系，有可能为其提供一种新的治疗策略。肝癌高表达转录本（the highly upregulated in 1iver cancer，HULC）是LncRNA的一种，最早发现于肝细胞癌［6］，并在肺癌、胃癌、结直肠癌等恶性肿瘤中出现异常的表达上调［7-9］，但其与GBM之间的研究尚少，本实验通过体外细胞实验及构建小鼠异种移植模型，初步探究了LncRNAHULC对GBM生长的作用机制，并将为后续更深入的研究及临床分子靶向治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞系与细胞培养

人脑胶质母细胞瘤U87细胞系（中国典型培养物保藏中心，中国），用含100 mL/L胎牛血清（FBS，Biological Industries，以色列）的DMEM高糖培养基（Biological Industries，以色列）及10 mL/L青霉素/链霉素（碧云天生物科技有限公司，中国）培养，通过载体构建、病毒包装侵染将HULC模拟物及抑制剂和对应的空白载体分别转染至U87细胞中，再通过致死浓度检测和稳筛株构建获得过表达组（HULC-over组）及其对照组（VEC组）和沉默表达组（HULC-siRNA组）及其对照组（NC组）稳定转染细胞。并置于37 ℃、体积分数5%CO2恒温培养箱中培养。构建载体过程中，过表达组HULC基因序列号为：NR_004855.2。针对该基因设计shRNA基因序列为：HULC-homo-140-s：GATCCGAACTCTGATCGTGGACATTTCAA⁃GAGAATGTCCACGATCAGAGTTCTTTTTTG，HULChomo-140-as：AATTCAAAAAAGAACTCTGATCGT⁃GGACATTCTCTTGAAATGTCCACGATCAGAGTTC⁃G；shNC-s：GATCCGTTCTCCGAACGTGTCACGTT⁃TCAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGAACTTTTTT⁃G，shNC-as：AATTCAAAAAAGTTCTCCGAACGT⁃GTCACGTTCTCTTGAAACGTGACACGTTCGGAGA⁃ACG。

1.2 qRT-PCR

消化收集U87 HULC-over组及VEC组和HULC-siRNA组及NC组细胞，使用总RNA提取试剂盒（QIAGEN，德国）提取总RNA。使用cDNA逆转录试剂盒（Thermo Fisher Scientific，美国），根据说明书进行互补DNA（cDNA）合成。使用Power SYBR Green Master Mix（Applied Biosystems，美国）和ABI 7500 Fast Real-Time PCR System（Applied Biosystems，美国）定量HULC信使RNA（mRNA）水平，并用2-△△Ct表示HULC mRNA的相对表达量。GAPDH作为HULC的内参，实验重复3次。

1.3 增殖实验

分别收集HULC-over组及VEC组和HULCsiRNA组及NC组细胞，重悬计数并调整细胞浓度。准备4块96孔板，每组细胞设3个复孔，向每孔加入100 μL细胞悬液（含2 000个细胞），在细胞周围一圈每孔加入200 μL PBS溶液，置于恒温培养箱中培养。待细胞贴壁后，取出一块96孔板，弃去原培养基，每孔加入100 μL 100 mL/L CCK8混合液，置培养箱中孵育2 h后用酶标仪检测450nm处的吸光度值（OD值），此为24 h OD值，余下的96孔板每孔补加完全培养基100 μL，并依次在48、72和96 h以同样的方法检测相应的OD值。实验重复3次。

1.4 克隆形成实验

分别收集HULC-over组及VEC组和HULCsiRNA组及NC组细胞。在6孔板中以低密度（300个细胞/孔）接种，每组设3个复孔。4 d后更换培养基，并于10～12 d后终止培养。用40 g/L多聚甲醛固定细胞，并用结晶紫染色。在显微镜下计数大于50个细胞的克隆细胞数量，克隆形成率（%）=克隆数/实际接种细胞数×100%。实验重复3次。

1.5 凋亡实验

用不含EDTA的胰酶消化并收集细胞，用预冷PBS洗涤两遍，然后按照Annexin V-488/PI Apoptosis试剂盒（Invitrogen，美国）进行实验。最后，通过流式细胞仪检测。实验重复3次。

1.6 体内实验

1.6.1 建立小鼠原位异种移植模型 动物实验设计经中国科学技术大学动物实验伦理审查委员会批准，符合动物实验伦理（伦理号：USTCA⁃CUC1801033），所有的操作和实验流程均遵守《实验动物管理条例》，实验动物由专人饲养于中国科学技术大学实验动物中心SPF级动物实验室。随机将重约17～20 g的40只健康雌性5～7周无胸腺裸鼠（BALB/c-Foxn1nu/Nju，购自南京大学模式动物研究所，SPF级，许可证号：SCXK（苏）2018-0008）按照注射U87细胞对应分为HULC-over组（n=10）和VEC组（n=10）及HULC-siRNA组（n=10）和NC组（n=10），麻醉后置于单臂数显立体定位仪中，于前囟前1 mm，中线右侧2～3 mm处以颅骨钻钻孔，将悬浮于5 μL PBS的1×106各组细胞分别注射入颅内。以后每3 d观察小鼠运动能力及神经系统体征，并每周称重1次。当裸鼠出现明显消瘦，蜷缩不动，对外界刺激无反应等恶病质或神经运动功能明显下降的体征时，对其处以安乐死，并立即剥离脑组织及肿瘤组织，用PBS冲洗后，肉眼查看鼠脑组织表面情况，分辨肿瘤结构以及与周围脑组织的浸润程度，并将其固定于40 g/L多聚甲醛中24 h，待进行后续实验。

1.6.2 组织切片及免疫组织化学染色 固定后组织经取材、脱水、浸蜡，石蜡包埋、切片（厚4 μm），进行HE染色和免疫组化染色。光学显微镜诊断鼠脑移植瘤的组织学形态，并观察浸润、血管生长、坏死等特征。全自动免疫组化仪（Roche Ventana，美国）进行Ki67的免疫组织化学染色。抗体稀释为1∶200（购自北京中山生物技术有限公司）。PBS替代抗体作为阴性对照。Ki67蛋白定位于细胞核中。阳性染色为浅黄色，黄色或棕色。在显微镜下的每个切片上观察到10个随机选择的视野，进行免疫组织化学方法的半定量分析。计算阳性染色细胞的百分比：0分小于5%；1分为6%～25%；2分为26%～50%；3分为51%～75%；4分为＞75%。染色强度等级为0分为阴性，浅黄色为1分；黄色或深黄色2分，棕色或深棕色3分。两次得分相乘均为免疫组织化学的最终得分。

1.7 统计学分析

使用SPSS 22.0和GraphPad Prism 7软件分析该研究中的数据。呈正态分布的测量数据用平均值±标准差（mean± SD）。两组独立样本间的比较，符合正态分布及方差齐性的数据采用独立样本t检验（CCK8增殖曲线采用组内RM one-way ANOVA分析，组间独立样本t检验）。生存期分析采用log-rank（Mantel-Cox）检验。P＜0.05时认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 HULC表达水平检测

qRT-PCR检 测HULC表 达，与VEC组相比，HULC-over组中HULC表达显著升高（图1A），差异具有统计学意义（t=31.82，P＜0.0001）；与NC组 相比，HULC-siRNA组的HULC表 达水平显著减少（图1B），差异具有统计学意义（t=4.84，P=0.008）。

2.2 HULC促进胶质母细胞瘤U87细胞体外增殖

CCK8增殖实验和克隆形成实验结果显示，HULC-over组细胞增殖率高于VEC组，HULCsiRNA组细胞增殖率低于NC组（图2A，B）。细胞克隆实验显示VEC组和HULC-over组克隆形成率分别为（34.47±1.56）%和（95.4±2.74）%；NC组和HULC-siRNA组克隆形成率分别为（23.83±0.92）%和（10.23±0.61）%，HULC-over组克隆形成率高于VEC组，HULC-siRNA组克隆形成率低于NC组（图2C，D）。实验证明HULC促进U87细胞体外增殖。上述实验差异均具有统计学意义（图2A：HULC-over：F=276.7，P＜0.0001；VEC：F=276.7，P=0.0001；第2天：t=10.6，P＜0.0001，第3天：t=11.48，P＜0.0001，第4天：t=9.91，P＜0.0001；图2B：HULC-siRNA：F=38.9，P=0.0004；NC：F=1439，P＜0.0001；第2天：t=8.89，P=0.0001，第3天：t=11.51，P＜0.0001，第4天：t=20.77，P＜0.0001；图2C：t=21.29，P＜0.0001；图2D：t=18.64，P＜0.0001）。

2.3 HULC抑制胶质母细胞瘤U87细胞凋亡

流式细胞分析显示，VEC组和HULC-over组早期凋亡率分别为（3.55±0.56）%，（0.09±0.01）%，HULC-over组细胞凋亡率低于VEC组（图3A），实验差异具有统计学意义（t=6.21，P=0.0034）；NC组和HULC-siRNA组早期凋亡率分别为（2.89±0.67）%，（7.13±0.14）%，HULC-siRNA组细胞凋亡率高于NC组（图3B），实验差异具有统计学意义（t=6.22，P=0.0034）。说明HULC可以抑制细胞凋亡，从而促进细胞增殖。

图1 U87稳转细胞株中HULC表达水平验证Fig.1 Verification of HULC expression levels in U87 stably transfected cell lines

图2 HULC促进U87细胞体外增殖Fig.2 HULC promotes proliferation of U87 cells in vitro

2.4 HULC促进体内胶质母细胞瘤的生长

HULC-over组比HULC-siRNA组小鼠生存期明显缩短，对照组生存期则在两者之间（图4A），实验差异具有统计学意义（χ2=20.31，P=0.0001）。鼠脑肿瘤组织中，与VEC组相比，HULC-over组中HULC表达显著升高，差异具有统计学意义（t=5.57，P＜0.000 1）；与NC组相比，HULC-siRNA组的HULC表达水平显著减少，差异具有统计学意义（t=10.72，P＜0.000 1）。显微镜观察HE切片，低倍镜下（×40）可见宿主脑组织中肿瘤组织境界不清，呈浸润性生长（图4C）；高倍镜下（×200）可见GBM细胞异型性、核分裂象，肿瘤组织黏液样变性，地图状坏死及血管形成（图4D）。说明成功构建GBM原位移植瘤模型，并且GBM在鼠脑中呈恶性生长。观察免疫组化结果（×200），与VEC组相比，Ki67在HULC-over组中蛋白表达水平更高，实验差异具有统计学意义（t=3.64，P=0.022）；与NC组相比，Ki67在HULC-siRNA组中蛋白表达水平更低（图4E），实验差异具有统计学意义（t=4.03，P=0.016）。说明HULC促进GBM体内生长并缩短小鼠生存期。

图3 HULC抑制U87细胞凋亡Fig.3 HULC inhibits apoptosis of U87 cells

3 讨论

胶质母细胞瘤是脑肿瘤中最常见和最具侵袭性的病理类型，其死亡率居高不下，严重危害了人类健康。因此，早期诊断对GBM至关重要，而生物标志物更是诊治的重中之重［10］。早期研究认为LncRNA是一段长度超过200nt的没有蛋白质编码功能的“垃圾基因”［11］。但近年来，越来越多的报道表明，LncRNA在转录、翻译调控及表观遗传修饰的过程中发挥关键作用，它们通过与DNA、RNA、蛋白质等分子结合来发挥生物学功能，包括增殖、凋亡、侵袭及迁移等，在肿瘤的形成及生长过程中发挥重要作用［12-13］，这为发现新的生物标志物起到推动作用。

HULC是位于人类基因组6p24.3，长度为500 bp的LncRNA［6］，它已被证实在多种恶性肿瘤中发挥促癌基因的作用［14-15］。Li等［14］发现HULC在骨肉瘤中表达上调并促进骨肉瘤的发生。Xu［15］等发现HULC通过调节PTPRO/NF-κB信号通路促进肺鳞状细胞癌的发展。本课题组Yan等［16］前期研究发现，LncRNA HULC在患者GBM组织和细胞系中的表达水平较正常脑组织明显上调，提示其可能在GBM中可能发挥促癌作用。本研究在此基础上初步分析了LncRNA HULC在GBM发病机制中的作用。在细胞水平，LncRNA HULC过表达可显著增强GBM U87细胞增殖能力，并且抑制细胞早期凋亡；在动物水平，LncRNA HULC过表达可促进肿瘤组织生长并减少小鼠生存期。这些研究结果表明，LncRNA HULC在GBM中起癌基因的作用，并可能作为潜在的预后指标。

图4 上调HULC促进胶质母细胞瘤体内进程，反之则抑制Fig.4 Up-regulation of HULC promote GBM progression in vivo，suppress Conversely

增殖与凋亡之间的不平衡是癌细胞最重要的特征之一。因此，抑制癌细胞增殖或诱导其凋亡都被认为是癌症的有效治疗手段［17］。Wang［18］等研究认为Bcl-2和Bax之间的相互作用在细胞凋亡中起决定性作用，Bcl-2通过抑制细胞色素C的释放来抑制细胞凋亡，Bax通过促进细胞色素C的释放和多种caspase依赖性信号通路来诱导细胞凋亡。本研究表明下调LncRNA HULC表达可导致U87细胞凋亡率明显升高，增殖能力明显下降。体内实验表明，下调LncRNA HULC表达可明显降低肿瘤侵袭性，减少组织坏死，从而延长小鼠生存期，并且Ki67的表达水平明显降低说明下调LncRNA HULC会抑制肿瘤细胞增殖。故下调LncRNA HULC表达能够抑制肿瘤生长，促进肿瘤细胞凋亡。大量文献报道指出PI3K/AKT信号通路是细胞中重要的信号通路，它广泛参与细胞增殖、凋亡及侵袭等细胞功能的调节［19］。PI3K/AKT信号通路的异常激活已在多种癌细胞中被证实，其中包括GBM细胞。Rui等［20］指出LncRNA HULC下调可抑制大鼠垂体腺瘤GH3细胞的增殖、迁移及激素分泌，并促进其凋亡，其机制是HULC与miR-130b相互作用，下调FOXM1的表达，从而抑制了PI3K/AKT信号通路。Miao等［21］研究认为PI3K/AKT信号通路是驱动肿瘤细胞异常增殖，分化和侵袭的关键，EMP1可通过激活PI3K/AKT信号通路促进GBM细胞增殖［21］。据报道AKT的激活可以磷酸化多种下游靶分子，例如Bcl-2家族，糖原合酶激酶3（GSK3）和细胞周期蛋白G1，它们对细胞存活，细胞增殖和凋亡具有重要影响［18］。因此可以推测，LncRNA HULC可能通过PI3K/AKT信号通路调节Bcl-2/Bax蛋白及细胞周期蛋白G1的表达来影响GBM细胞的增殖及凋亡，相关通路及蛋白水平的研究有待进一步的验证。

综上所述，LncRNA HULC在体内、体外均有促进GBM生长的作用，后期我们将进一步探究该LncRNA与靶基因之间的分子机制，这将为发现新的生物标志物及GBM治疗靶点提供理论依据。