蛋白质药物糖基化工程化改造研究进展

杜力,刘晓志,魏敬双,高健

华北制药集团新药研究开发有限责任公司, 抗体药物研制国家重点实验室, 石家庄 050015

与小分子药物相比，重组治疗蛋白药物因靶向特异性高、副作用小而越来越受欢迎。重组胰岛素是1982年礼来公司在大肠杆菌中生产的第一种FDA批准的生物治疗药物，商标名为Humulin©(Carter 2011)。Humulin©是一种非糖基化的蛋白质，因此利用大肠杆菌进行生产。促红细胞生成素是1985年美国食品和药物管理局(Food and Drug Adminstration,FDA)批准的第一种糖基化重组糖蛋白，由Amgen公司在中国仓鼠卵巢细胞中产生，商品名为Epogen[1]。现临床使用的大部分重组治疗蛋白药物为糖基化蛋白，糖基化是产品的关键质量属性，其组成将影响蛋白质的折叠、稳定性、溶解性和细胞内转运。因此，糖基化对糖蛋白生物学功能具有重要影响，应对生产过程加以控制，以使蛋白药物达到最佳的治疗效果[2]。由于生产宿主细胞种类和生理状态不同，造成重组糖蛋白的糖基化模式具有明显差异[3]。大部分重组糖蛋白上的非均质聚糖结构是在粗面内质网和高尔基体内糖基化过程中产生的。近年来,研究者对糖基化进行了大量研究，以克服聚糖异质性，并建立体内和体外糖工程技术用于高效生产均一化的糖蛋白药物[4]。定制糖基化技术不但是研究糖蛋白药物治疗中聚糖功能必不可少的工程手段，也代表了下一代新型蛋白药物的发展方向。本文综述了蛋白质药物的 N-糖基化改造和O-糖基化改造的最新进展，以期为定制糖基化技术的相关研究提供参考。

1 蛋白质药物的 N-糖基化改造

蛋白质糖基化是在新合成的蛋白质上，一个多糖与天冬酰胺(N-糖基化)侧链中的酰胺的连接。蛋白质的N-糖基化开始于内质网(endoplasmic reticulum，ER)内腔，在酶的催化作用下将寡糖前体转移到多肽上的Asn-X-Ser/Thr(其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸)序列上。这种最初的聚糖转移反应是由异聚低聚糖基转移酶(oligosaccharyl transferase，OST)催化完成的[5]。低聚糖转移后，两个末端的葡萄糖残基立即被α-葡萄糖苷酶I和II分解，产生的具有单葡萄糖的酰化聚糖结构，再与ER膜结合凝集素钙黏蛋白或可溶性钙网蛋白反应[6]。这些凝集素在一个依赖于聚糖的蛋白质循环中支持蛋白质的折叠。具有天然构象的分泌性糖蛋白从钙黏蛋白/钙网蛋白循环中释放，并从ER分泌到高尔基体[7]。在高尔基体中，成熟折叠的糖蛋白上的ER-低聚甘露聚糖经过进一步的N-甘露聚糖加工，产生具有不同功能性质的高度多样性复合的N-甘露聚糖[8]。

1.1 蛋白药物N-糖基化改造的基本策略

糖蛋白药物的异质性来源于糖基化位点及糖基化效率。糖基化效率的差异取决于制备系统和蛋白质的固有特征[9]。几乎所有真核细胞都具有蛋白N-糖基化功能，Asn-X-Ser/Thr序列的存在是必须的，但在不同物种间，糖基化位点上存在差异。因此，这种差异导致重组蛋白的异常糖基化。蛋白质内在因素，如氨基酸序列和二级结构，以及其他蛋白修饰的存在，如二硫键形成，都有助于提高N-糖基化效率[10]。哺乳动物细胞包含两种OST复合物，它们的催化亚单位和辅助蛋白不同，这些OST复合物功能相似，但也对不同的糖蛋白底物存在偏好。基因构建统一的OST复合物是克服N-糖基化位点占有率差异的一种途径[11]。然而，在真核生物中，不同的OST催化亚单位及其附属蛋白的特殊作用还没有被完全阐述，使得基因构建合成存在困难[12]。在利什曼原虫等原生动物中，OST复合物由一个单亚单位组成，该亚单位可取代整个酿酒酵母复合物，并可用于克服蛋白质的糖基化不足。甲基缺陷型毕赤酵母中过度表达单亚单位OST，使单克隆抗体的N-糖基化位点效率从75%增加到85%，甚至超过99%。

另一种降低异质蛋白的基因技术，是突变N-糖基化蛋白序列，例如，将真核生物中Asn-X-Ser突变为Asn-X-Thr能够有效提高N-糖基化效率[13]。除了修改共识序列本身，相邻的氨基酸也可以改变以提高N-糖基化的效率。这些基因技术的主要缺点是改变了治疗性糖蛋白的主要氨基酸序列，这可能会影响蛋白质的性质，并可能产生其他问题。然而，新兴N-糖基化位点技术已经成功用于重组蛋白设计，这种方法最突出的例子是Darboetin Alfa方法。这种高糖基化重组促红细胞生成素(erthropoietin,EPO)异构体被设计成携带5个N-糖基化位点，另外增加的两种N-聚糖，不但增加了蛋白质半衰期，还提高了蛋白质唾液酸总含量[14]。在另一项更优秀的设计中，将一个新的N-糖基化位点引入抗HIV-1受体CD4的单克隆抗体的轻链中，大大提高了抗体对病毒的中和活性。总之，这些例子说明，通过蛋白质基因技术可以增加蛋白质额外糖基化[15]。

通常重组糖蛋白的表达系统产生同一蛋白质的不同聚糖的混合物。这意味着哺乳动物细胞的N-糖元显示了广泛的N-聚糖成分，从低聚甘露糖到支链复合型N-聚糖。N-聚糖微不均一性源于加工的变化，这取决于许多细胞因素，包括加工酶的组织/细胞类型特异性表达、浓度和酶动力学参数、核苷酸糖供体和糖蛋白的可用性、在高尔基体中的停留时间等。此外，蛋白质结构特性对特异N-聚糖位点加工有很大的影响。利用糖生物学方法控制糖基化酶的转录表达，进而影响鼠组织或癌细胞糖蛋白上的N-聚糖结构[16]。在小鼠组织中，岩藻糖残基转移酶与相应岩藻糖基转移酶的转录表达呈正相关。另一方面，对于复杂的N-聚糖形成或唾液酸化的影响不确定，这突出了这些修饰和生成步骤的复杂性。此外，研究者还建立数学模型来预测酶的表达、亚细胞定位、核苷酸糖水平和培养条件对聚糖加工的影响。虽然所描述的模型可能有助于预测重组单克隆抗体上相当均匀的Fc-糖基化，但这些模型假设还必须通过实验数据进行验证[17]。此外，目前数学模型的稳健性正在重组糖蛋白的宿主细胞中进行测试，包括测试重组糖蛋白异质，糖基化模式包括N-聚糖的分支和唾液酸化[18]。

产生糖基化微小异质性的因素包括同一低聚糖底物参与不同酶竞争以及内源性糖蛋白对高尔基体加工干扰和接触时间的差异。人们普遍认为高尔基体加工酶是按顺序排列在高尔基体内，但通常存在多个酶重叠分布的现象。这些酶可以修饰相同的聚糖中间体结构，阻断其他糖基转移酶和糖苷酶的作用。例如，通过向复合N-聚糖中添加N-乙酰葡萄糖胺、N-乙酰氨基葡萄糖转移酶III抑制剂，可防止其他高尔基体内糖基转移酶进一步修饰。这种底物竞争和进一步加工抑制是Glycart生物技术公司开发的糖基化单克隆抗体的关键技术，该技术用于生产减少α-1,6-连接核心岩藻糖含量的糖基化工程单克隆抗体。由该平台构建的一种抗CD20的Obinutuzumab单克隆抗体最近被美国FDA批准用于治疗慢性淋巴细胞白血病。复杂N-聚糖的底物相同，其常见的修饰为半乳糖基化和多分支化[19]。除了在同一生物中参与这些竞争反应外，还参与分解代谢过程。细胞外α-神经氨酸酶或β-己糖胺酶可与末端糖残基作用，并在分泌后将其从暴露的N-聚糖中去除，导致重组糖蛋白上的聚糖类别发生变化[20]。因此，基因失活或抑制竞争性糖基转移酶和糖苷水解酶是防止不想要的聚糖修饰和降低糖基化的有效策略[21]。在酵母或植物中成功地产生具有均匀糖基化的重组糖蛋白治疗药物，其N-聚糖加工机制比哺乳动物细胞要简单得多。在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中，研究表明“简化策略”在哺乳动物细胞中也是可行的。在高尔基体内缺乏UDP半乳糖的LEC8 CHO细胞中产生的抗体表现为均一N-聚糖[22]。

重组糖蛋白在高尔基体内的停留时间与膜的接触时间以及聚糖修饰酶是影响蛋白质微异质性的其他因素。蛋白质在高尔基体的停留时间和通过高尔基体的转运动力学方面存在差异，导致对聚糖修饰的差异。停留时间分布和与糖基化酶的相互作用取决于高尔基体内转运模式(囊泡运输/管状连接、池成熟、快速分割或混合模型)、细胞类型和特有机体组织类型[23]。此外，最新研究表明，蛋白质通过不同机制转运也可能与不同的高尔基体酶相互作用。对于某些糖基化过程已经证明其跳过了某些糖基化酶的修饰。尽管在这一领域取得了一些进展，但是还不能获得对于不同重组糖蛋白的高尔基体动力学以及对甘氨酸产生影响的基础实验数据，所以还不能合理地设计产生更均匀甘氨酸结构的基因工程化转运和其他转运途径。换句话说，对于许多基于细胞的表达系统，我们需要更好地了解细胞运输过程，以减少与糖基化匀质相关的高尔基体停留时间或高尔基体内运输。

对位点特异性修饰主要取决于蛋白质的序列和结构。某些蛋白质构象通过空间位阻完全阻止或限制加工酶进入[24]。像Cetuximab单克隆抗体在重链可变区域加上一个额外的N-聚糖是在同一分子上进行位点特异性的典范。虽然Cetuximab Fc上的N-聚糖的修饰程度较低，但可变区域的N-聚糖暴露程度较高。在不改变蛋白质功能的情况下，设计蛋白质内在特征的策略是具有挑战性的，但增加获得蛋白质结构以及强大的分子动力学模拟将为位点特异性聚糖基因克隆提供新的可能性。或者，针对松驰的或新颖的底物特异性的聚糖修饰酶的合理设计可以对一些位点进行更有效的处理。

1.2 蛋白质药物表达系统的糖基化改造

目前，用于糖蛋白治疗药物的大多数表达系统产生的N-聚糖化均不是人的糖基化，因此可能导致药物的潜在副作用。这些非人源表位可能会引起不必要的免疫反应，从而中和所使用的药物，甚至引起超敏反应。

1.2.1哺乳动物细胞的糖基化改造 在CHO细胞中产生的重组糖蛋白携带非人源的唾液酸N-乙醇亚甲亚酸(Neu5Gc)。此外，由于CHO细胞缺乏相应的α-2,6-唾液酸转移酶活性，因此CHO细胞以α-2,3-键连接N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)，而不是以α-2,6-键连接，而α-2,6-键主要存在于人类糖蛋白的N-聚糖上。已有研究已经提出了许多不同的方法来消除Neu5Gc 糖基化，最直接的糖基化基因克隆技术策略是编码CMP-Neu5Ac 羟化酶基因的敲除，这种酶可以将CMP-Neu5Ac 转化为CMP-Neu5Gc。同样，α-2，3-唾液酸转化酶可以通过基因消除技术、异位表达来缺失α-2，6-唾液酸转化酶，从而产生人的N-糖基化蛋白[25]。NS0和SP2/0小鼠骨髓瘤或幼鼠仓鼠肾(BHK)细胞产生具有半乳糖-1,3-半乳糖的糖蛋白，代表人类的抗基因表位。具有代表性的α-1,3-半乳糖基转移酶在人类中是不活跃的，但存在于大多数非人的哺乳动物细胞系中。BHK细胞产生的重组人凝血因子Ⅷ(rhFVIII)携带3%的α-Gal表位，但在人胚胎肾细胞(HEK293)中产生的rhFVIII上未检测到该表位。大量的α-Gal表位明显存在于来自西妥昔单抗可变区的N-糖基化蛋白中，Cetuximab单抗在SP2/0小鼠骨髓瘤细胞中产生且在世界范围内被批准用于治疗不同类型的癌症。在美国，一些西妥昔单抗治疗的患者对该药物的过敏反应与α-Gal表位的存在有关。这个例子强调了糖克隆基因技术对于产生治疗性更好的蛋白的重要性[25]。

HEK293细胞表达重组蛋白的糖基化可能是高度异质性的，包括具有不同的双触角和分支结构的末端糖残基，因此，不一定类似于血清中的N-糖基化蛋白。尽管已有研究报道人细胞缺乏N-聚糖加工步骤(例如，GnTI缺陷)，但德国Glyctope公司可以提供人糖基化基因技术产生的人细胞重组糖蛋白，在人类细胞中产生匀质复杂的糖基化蛋白[26]。 比较CHO和HEK293细胞中表达的几种不同蛋白质表明，HEK293细胞产生的重组糖蛋白中，N-糖基化与唾液酸含量显著降低。除了降低异质性外，人细胞的糖基化基因技术的潜在目标是消除核心岩藻糖和N-乙酰氨基葡萄糖转移酶III，后者产生平分型的N-乙酰葡糖胺，从而阻止分支蛋白和唾液酸化酶的进一步加工和过度表达[27-28]。

1.2.2酵母细胞的糖基化改造 酵母的高甘露糖基化N-聚糖结构与人N-聚糖基化有显著差异，可能引起影响药物生物活性的免疫原性反应。在巴斯德酵母的开创性工作表明，通过消除有害的甘露糖基转移酶和控制其他物种的甘露糖酶和N-乙酰氨基葡萄糖转移酶的表达，可以在酵母中生成人源N-聚糖。GlycoFi公司成功对糖基化酶组合库进行高通量筛选，设计了用于区分亚细胞定位和高效生产，以及用于生产特定N-聚糖的重组蛋白。最近，本团队采用了相似但更合理的设计方法来消除高甘露糖，并设计了巴斯德酵母、酿酒酵母、耶氏解脂酵母和汉逊酵母，来生产具有人源化N-聚糖基化的重组糖蛋白[29]。

1.2.3昆虫细胞的糖基化改造 昆虫细胞通常会产生短N-聚糖，这是由于β-己糖胺酶的作用。此外，在一些昆虫细胞系中表达的重组糖蛋白上存在潜在的免疫原性核心α-1,3-岩藻糖残基。为了克服这些缺点，研究者开发了不同的方法，并开发了糖工程昆虫细胞，在岩藻糖缺乏的情况下，产生半乳糖基化N-聚糖的单克隆抗体。

1.2.4植物细胞的糖基化改造 植物通常产生相当简单的四分位复合N-聚糖，其上连有β-1,2-木糖和核心α-1,3-岩藻糖残基，哺乳动物的N-聚糖上未发现这些糖基化，为潜在的免疫原性残基。基因敲除已成功地用于从不同植物生产的重组治疗糖蛋白药物中去除β-1,2-木糖和核心α-1,3-岩藻糖。与通常CHO细胞产生的重组单克隆抗体相比，植物细胞的单克隆抗体的N-聚糖高度更加均匀，主要表现为GlcNAc2Man3GlcNAc2-聚糖，这是进一步修饰如分支或半乳糖基化的最佳底物[30]。值得注意的是，基于烟草植物表达平台还能够产生功能性的特定糖基化的重组IgM变异体，目前用于制造抗埃博拉病毒的单克隆抗体[27]。

与昆虫细胞相似，植物也含有β-己糖胺酶，它能从一些重组糖蛋白中去除谷氨酰胺残基，并在截短的N-聚糖上暴露末端甘露糖。虽然高尔基体后加工过程可以通过相应的β-己糖胺酶基因敲除来预防，但带有末端甘露糖残基的N-糖聚合物是用于酶替代疗法治疗溶酶体储存疾病的重组糖蛋白的有益结构。植物生产的重组葡萄糖脑苷脂酶已于2013年被FDA批准用于治疗Gaucher病。这种药物在基因修饰的胡萝卜细胞中表达，主要含有Man3XylFucGlcNAc2糖，被人体甘露糖受体有效地内化。与其他市售重组葡糖脑苷脂酶相比，在生产过程中，不需要任何体外糖苷酶消化或α-甘露糖苷酶抑制剂生产具有末端甘露糖残基的N-聚糖。

1.3 其他N-糖基化改造技术

可以通过基因技术引入额外的糖残基来设计有益的特性，这些糖残基形成新的识别位点，或者屏蔽清除的受体结合位点。例如，通过增加重组糖蛋白的唾液酸含量来获得更好的药代动力学行为。在哺乳动物细胞以及包括酵母、昆虫细胞和植物在内的非哺乳动物系统中都产生了高度唾液化的EPO变体。此外，抗体的唾液酸化被认为对抗炎症的特性起着重要作用。然而，在这种情况下，唾液酸化IgG的潜在用途仍然存在争议，因为用于进行研究的糖基化蛋白往往是异质的。在优化活性的糖基化基因技术中，不需要的糖基转移酶通常被灭活以防止单糖转移到聚糖结构中。去除核心α-1，6-岩藻基转移酶技术被用于产生缺少核心岩藻糖的N-聚糖的CHO细胞。另一种方法可以改变特定核苷酸糖的浓度，例如，通过相应核苷酸糖转运子的失活、过度表达或核苷酸糖流量的代谢控制。已有研究表明，N-聚糖的分支对UDP N-乙酰葡糖胺(N-GlcNAc)浓度的变化很敏感，UDP-GlcNAc被参与复杂N-聚糖形成和N-聚糖分支起始的酶用作供体底物。由于UDP-GlcNAc水平依赖于己糖胺途径，代谢控制可用于修饰N-聚糖分支，这可产生增加唾液酸和延长半衰期的治疗性蛋白质药物。

哺乳动物的N型糖基化蛋白表达途径已被设计成大肠杆菌表达，重组糖蛋白的N-糖基化途径已被基本阐明。这种糖基化基因技术的尝试非常有发展前途，但目前受到所用细菌OST的受体位点特异性的限制。优化蛋白质基因序列将有助于克服这些瓶颈。

合成和半合成方法已被应用于优化重组蛋白质上的N-糖基化，并生成具有特定聚糖结构的均质糖蛋白。体外方法包括完全化学合成糖蛋白法，如唾液酸化EPO或涉及细胞生成，随后进行化学或酶后修饰以获得均匀的糖蛋白。最近，体外孵育的β-1,4-半乳糖基转移酶和α-2,6-唾液酸转移酶及其相应的核苷酸糖(UDP-Gal, CMP-Neu5Ac)可以被用来增加唾液酸含量和商业化静脉免疫球蛋白(IVIg)的均一性。在体外生产过程中α-神经氨酸酶、β-半乳糖苷酶和β-N-乙酰氨基葡萄糖酶被重组葡糖脑苷酶上暴露的甘露糖残基利用产生N-聚糖。除了对现有N-聚糖进行逐步修饰外，还采用酶法去除异源聚糖和体外酶法转移添加的低聚糖构建均匀的唾液酸化IgG-FC片段，用以研究唾液酸化的抗炎作用 。重组糖蛋白在真核细胞甚至基因工程细菌中分泌，可以产生不同的N-糖基化。不同种细胞N-聚糖被特异性内糖苷酶酶切去除，留下含有单个N-连接的乙酰葡糖胺的糖蛋白。酶促转糖基化是将结构均一的、预合成的低聚糖添加到N-连接的乙酰葡糖胺中，产生具有特定N-聚糖的糖蛋白。虽然通过这种化学酶再加工策略可以在糖蛋白上生成均一的聚糖，但在工业化生产中仍然使用半合成法生产治疗性糖蛋白药物。

Callewaert小组最近开发了一种类似体内加工人体细胞N-聚糖蛋白的系统。在糖删除策略中，基因技术将内糖苷酶介导的酶法去除N-聚糖过程加到GnTI缺陷的HEK293细胞中，使高尔基体中生成N-乙酰葡糖胺修饰的糖蛋白。内源性半乳糖基转移酶和唾液酸转移酶可进一步拉长N-连接的乙酰葡糖胺，产生3个被截短的N-连接的乙酰葡糖胺。在糖删除系统中产生的重组抗体显示出的特殊特征，需要进一步测试，以充分评估这种新的糖基因技术的应用情况。

2 O-糖基化的工程化改造

哺乳动物分泌的蛋白中有不同类型的O-糖基化(例如，O-连接岩藻糖、葡萄糖、甘露糖、木糖或乙酰半乳糖胺)。高浓度粘蛋白型O-聚糖的形成是由多肽乙酰半乳糖胺-转移酶家族启动的。在这种常见的哺乳动物O-糖基化过程中，高尔基体中的多肽乙酰半乳糖胺转移酶将单个乙酰半乳糖胺残基转移到完全折叠的蛋白质的丝氨酸/苏氨酸位点，这些蛋白质不能显示明确的一致序列。随后的逐步延伸通常由不同的糖基转移酶进行，从而形成高度多样的核心O-聚糖结构。

值得注意的是，不同的O-聚糖对药物治疗效果的贡献(例如，含有单一O-聚糖的EPO)仍然没有得到很好的研究。因此，O-聚糖基因工程技术的具体目标明显不如N-聚糖化技术。开发能够产生特定O-聚糖的系统对于提高对糖蛋白治疗中O-聚糖作用的理解至关重要。例如，IgA抗体作为一种新的抗感染或杀伤肿瘤细胞的药物具有很高的潜力。IgA1抗体铰链区O-聚糖残基的高度唾液酸化结构的基因克隆技术为优化重组IgA1类治疗药物的稳定性和药代动力学行为提供了一个有趣的靶点。哺乳动物细胞中的粘蛋白型O-糖基化通常在位点占据的频率上变化，使蛋白为显示不同结构的混合物。在人类细胞中，同种粘蛋白型O-聚糖的产生受到竞争性糖基转移酶的极大限制。昆虫细胞可以产生一些粘蛋白类型的修饰，但也可以产生许多结构多样的非人类的O-聚糖，包括岩藻糖和己糖酸的结合，以及更多的磷胆碱或硫酸盐替代品。与动物细胞相比，酵母和植物中不包含典型的粘蛋白型O-糖基化合成系统，这使得这些哺乳动物型O-聚糖的合成不受内源性糖基转移酶的任何干扰。然而，来自毕式酵母的重组EPO含有两个甘露糖残基，连接到126位丝氨酸的单O-糖基化位点。这些O-甘露糖结构不同于哺乳动物α-二糖聚糖型O-甘露糖基化，当其存在于重组糖蛋白上时可能会引起不期望的副作用。植物可以将与重组蛋白O-糖基化位点相邻的暴露脯氨酸残基转化为羟基脯氨酸残基，它可以被阿拉伯糖基转移酶进一步修饰，产生小阿拉伯糖链[31]。

在哺乳动物中，对粘蛋白O型糖基化起始和延伸的控制是复杂的，还没有建立用于控制附着第一个单糖基因的共有序列，而有益于位点特异性O-糖基化的因素并不是很清楚。人多肽N-乙酰半乳糖胺转移酶家族由20个成员组成，它们差异表达，显示出不同的和重叠的肽-受体-底物特异性。CHO细胞主要产生核心1结构，这些结构可用于产生特定的和拉长的结构。消除O-聚糖异质性的策略包括在不能产生粘性蛋白的非哺乳动物宿主中表达重组糖蛋白，或系统地消除在哺乳动物细胞中启动或延长O-聚糖的酶[32]。

新的O-聚糖基化基因克隆技术已在酵母和植物细胞中成功应用。粘蛋白型核心O-聚糖，是在酿酒酵母细胞中人粘蛋白衍生肽上生成的。用于O-连接的乙酰半乳糖胺形成的机制已在植物中成功表达，并且有效地在本塞姆氏烟草产生的人EPO-Fc上产生二唾液酸化的核心O-聚糖。避免酵母非期望的O-甘露糖基化的策略涉及α-甘露糖苷酶的表达的基因工程技术。这种方法将产生单个O-连接的甘露糖，其可以通过哺乳动物类型的修饰进一步延长，例如产生α-三聚糖聚糖型O-聚糖。或者，可以通过用重组溶酶体甘露糖苷酶体外消化巴斯德毕赤酵母生成的糖蛋白来除去甘露糖残基，或者可以通过抑制所涉及的蛋白质O-甘露糖基转移酶来防止O-连接的甘露糖链的产生。在半合成O-聚糖基化基因工程方法中，在大肠杆菌中表达的多肽乙酰半乳糖胺-转移酶，可在重组蛋白上启动粘蛋白型O-糖基化。在体外应用聚糖的PEG化技术进一步修饰含有乙酰半乳糖胺的蛋白质可以增加蛋白质半衰期。已经使用类似的策略将PEG修饰的唾液酸连接到哺乳动物细胞中产生的重组血液因子FⅧ的O-聚糖上。

3 展望

近年来，制药行业已经在开发新型糖蛋白治疗方面付出了相当大的努力。 现有多种使用不同技术生成的糖基化基因工程技术的单克隆抗体药物，处于不同的临床试验阶段。用于IgG1表达的细胞糖基因技术主要集中在从重链Fc区中的天冬酰胺Asn297处的N-聚糖中消除核心-岩藻糖。 缺乏核心-岩藻糖增加了对Fcg RIII受体结合的亲和力，从而改善了对天然杀伤细胞的抗体依赖性细胞毒性。类似的糖基化依赖机制影响巨噬细胞的抗体依赖性细胞吞噬作用，并影响病毒中和抗体的受体介导效应器功能。用于治疗埃博拉病毒感染和逆转疾病的ZMAPP抗体混合物包含3种植物产生的缺乏核心岩藻糖残基抗体。在小鼠中，无岩藻糖的单克隆抗体13F6(ZMAPP成分之一)与含有岩藻糖核心的13F6变体相比，显示出明显增强的抗埃博拉病毒效力。这些例子清楚地证明了糖基化的影响，并突出了糖化工程单抗在人类中不同的应用潜力。因此，在不久的将来，批准用于不同疾病治疗的糖基化单克隆抗体的数量有望增加[33]。除了调节效应器功能外，未来的糖基化修饰策略还将集中在增强抗体抗炎特性的基因工程技术。具有大量末端唾液酸的IgG糖型对凝集素型受体的亲和力增强，可能是下一代抗体发展的另一个新领域。基因技术可以使治疗抗体药物、半衰期增强的重组糖蛋白药物以及用于酶替代的不同重组产品完全人源化糖基化[34]。

尽管我们还不完全了解影响和控制真核细胞表达糖基化蛋白的所有因素，但过去在宿主细胞中表达均一糖基化蛋白的基因技术方面已经取得了重大进展。利用基因组编辑工具，广泛整合分析数据，理解细胞过程，将有助于开发下一代表达特定重组糖蛋白药物的表达宿主。这些糖基化基因技术将使生物类似药的生产更容易，并产生新一代具有生物活性更好、改变糖基化、优化疗效和安全性的药物[35]。

糖基化在重组糖蛋白生物制药中的重要性越来越受到人们的重视，目前学术界和工业界都在为控制糖基化提供强有力的解决方案。细胞表达平台基因技术的最新进展表明，在哺乳动物细胞、酵母、昆虫细胞和植物等不同的系统中，可以表达特定和均一的N-聚糖结构蛋白。通过使用CRISPR/Cas等基因组编辑工具，可以消除物种和细胞类型的现有差异和缺点，并且在特定糖蛋白(如单克隆抗体、EPO)上产生已定义的N-聚糖的许多重塑工具已经用在不同的表达平台。通过使用CRISPR/Cas等基因组编辑工具，可以消除物种和细胞类型的差异和缺点，并且许多糖基修饰基因技术在不同的表达平台上应用可以表达特定糖蛋白(如单克隆抗体、EPO)。最终目标将是建立生产平台，用于生产所需结构的特定N-糖基化的重组糖蛋白药物。目前，这种“按需”N-聚糖基化包括有高度唾液酸化的四触角复合物N-聚糖、末端唾液酸化的双三元N-聚糖和缺乏岩藻糖的双三元N-聚糖。此外，有可能产生均一的低聚甘露糖苷结构，如特定的O-连接聚糖[36]。生产已定义的聚糖糖蛋白的方法将推动对聚糖功能的理解，从而为治疗性糖蛋白药物的糖基化基因技术提供新的靶点。

目前,我们还不了解大多数真核细胞中导致聚糖多样性的所有途径，对参与N-和O-糖基化(OST复合物和多肽乙酰葡糖胺-转移酶)起始的关键酶的认识也很有限。此外，由于很难制备具有长末端延伸的N-聚糖，如聚唾液酸化，这可能会显著延长半衰期。这种广泛的修饰可能取决于未知的因素，这些因素可能包括调节在高尔基体的保持或接触时间。更好地描述细胞因素，如高尔基体组织和货物的运输过程，对于克服当前的一些局限性至关重要。此外，利用现有的体内生产系统，很难实现位点特异性N-糖基化和N-聚糖制备,需要更多的研究来了解蛋白质内在影响特定聚糖与多肽序列和结构关系的因素，以及其他未知位点特异性糖基化方面的因素。与其他实验技术一起，分子动力学模拟将非常适合于研究碳水化合物-蛋白质的相互作用，并使开发N-聚糖的位点特异性再修饰策略成为可能。研究结构导向的蛋白质工程改变糖基化酶,如OST催化亚单位或聚糖加工酶的底物特异性，可为细胞生产系统中的位点特异性工程提供额外的工具。改变糖基化酶如OST催化亚单位或聚糖加酶的底物特异性的结构引导蛋白质的基因技术，可为细胞生产系统中的位点特异性的基因技术提供额外的工具。位点特异性修饰可以通过高级化学酶完成或用精确控制所附的聚糖结构来完成糖原蛋白的从头合成。生物制药工业或对特定实验室领域仍有兴趣采取这种复杂且费用高昂的办法。

未来的另一个挑战是尝试协调N-和O-聚糖糖基化的基因工程技术。到目前为止，只有理论研究证明了两种糖基化协调修饰途径的可行性。由于需要同时设计两条在同一亚细胞间隔中和利用相同核苷酸糖供体途径的基因技术，所以在制备条件下对这些修饰的控制将是一个巨大的挑战。更好地理解细胞生物学，如通过高尔基体的货物运输过程，以及开发用于引导核苷酸糖底物和加工酶工具，将是干扰不同细胞过程的更复杂方法的基础。最终，需要将实验获得的参数引入稳健模型中，以准确预测重组糖蛋白生物药物的N-和O-聚糖分布。鉴于治疗性的糖蛋白药物具有巨大的潜力，生物制药行业应扩大其在糖蛋白基因工程方面的努力，以促进具有特定性质和功能的下一代药物的开发。